Automated High-Throughput Oligo QC: From Automated Sample Preparation to MALDI Spectra Assessment

Význam tématu

Rychlá a spolehlivá kontrola kvality syntetických oligonukleotidů, jako jsou DNA primery, je klíčová v molekulární biologii i průmyslové analytice. Tradiční metody založené na HPLC jsou časově náročné a vyžadují manuální zásahy, zatímco MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie nabízí vyšší specifitu, rychlý screening a vhodnost pro vysoký objem vzorků. Automatizace přípravy vzorků navíc zvyšuje reprodukovatelnost a uvolňuje kapacity pracovníků pro analyticky hodnotnější úlohy.

Cíle a přehled studie / článku

Tento protokol popisuje kompletní workflow pro automatizovanou přípravu DNA primerů na robotické platformě, získání MALDI-TOF spekter a jejich automatizovanou interpretaci. Cílem je implementovat jednoduché pipetovací kroky do robota, využít speciálních MALDI destiček se vzorkovými body a následně v softwaru BioPharma Compass vyhodnotit klíčové kvalitatívní atributy oligonukleotidů bez nutnosti chromatografického dělení.

Použitá metodika a instrumentace

Syntetické primery byly rozpuštěny na koncentraci 500 fmol/µl a spolu s matricí na bázi 3-hydroxypikolinové kyseliny v roztoku diamonium citrátu naneseny robotickým pipetováním na MTP AnchorChip 384 destičky. Po zaschnutí vzorků byla prováděna automatizovaná akvizice spekter v pozitivním lineárním módu na zařízení autoflex maX. Data byla zpracována v softwaru flexAnalysis a následně importována do BioPharma Compass 2021 pro vícenásobné cílené screeningové hodnocení.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýzy šestice univerzálních primerů (17–20 mer) ve 48 replikátech prokázaly vysokou shodu s očekávaným profilom iontové distribuce. Hodnotily se tři hlavní atributy:

• Relativní intenzita hlavního iontu (base peak) – stanovený limit 99 % byl splněn ve všech případech.
• Mass accuracy – většina spekter vykázala odchylku lepší než 6 Da.
• Kosínusové skóre podobnosti profilů – většina výsledků měla hodnotu nad 0,9.

Pro snazší orientaci slouží barevná kódování (zelená pro vyhovující, žlutá pro střední a červená pro nevyhovující výsledky). Díky absence chromatografického kroku dosahuje kompletní automatizovaný proces zpracování 384 vzorků přibližně 50 minut, což umožňuje během jednoho osmihodinového pracovního dne zpracovat až deset destiček.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaná MALDI-TOF QC nabízí:

• Významné zvýšení throughput díky rychlé přípravě a analýze bez chromatografie.
• Snížení závislosti na zkušenostech operátora a zvýšení reprodukovatelnosti.
• Integraci výsledků v jediném softwarovém prostředí s přehlednými zprávami.
• Možnost zaměřit se sekundárně na složitější či nevyhovující vzorky pomocí LC-ESI QTOF.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry dalšího rozvoje zahrnují:

• Zavedení 384kanálových pipetových hlav pro masivní paralelní pipetování.
• Propojení s laboratořními informačními systémy a cloudovými platformami pro on-line monitoring.
• Nasazení strojového učení pro rozšířené vzorkové vzory a detekci neočekávaných kontaminantů.
• Rozšíření pracovního postupu pro delší oligonukleotidy a modifikované nukleotidy.

Závěr

Popsaný workflow demonstruje, že kombinace robotické přípravy vzorků a MALDI-TOF spektrometrie je efektivní řešení pro vysokopropustné QC syntetických oligonukleotidů. Metoda snižuje časovou a pracovní náročnost, zároveň poskytuje robustní, automatizované hodnocení kvality a umožňuje rychlou selekci vzorků pro sekundární analýzu.

Reference

1. Haslam C et al. 2016. The Evolution of MALDI-TOF Mass Spectrometry toward Ultra-High-Throughput Screening: 1536-Well Format and Beyond. J Biomol Screen 21(2):176–186.
2. Ritorto MS et al. 2014. Screening of DUB activity and specificity by MALDI-TOF mass spectrometry. Nat Commun 5:4763.
3. Bruker Daltonics. 2020. Rapid Oligonucleotides QC with Automated High Resolution ESI-LCMS and BioPharma Compass. Tech Note TN-51.
4. Bruker Daltonics. 2019. The Complete Solution: Oligonucleotide. Flash Note FN-007.