Development of Monoclonal Antibody Charge Variant Analysis Methods Using a BioResolve SCX mAb Column

Význam tématu

Monoklonální protilátky vykazují variabilitu náboje, která může ovlivnit jejich účinnost a bezpečnost. Charakterizace a sledování této heterogenity je klíčová pro kontrolu kvality biofarmaceutik a zajištění jejich biologické aktivity. Cation exchange chromatografie je díky vysokému izoelektrickému bodu protilátek nejvhodnější metodou pro analýzu jejich variant náboje.

Cíle a přehled studie

Účelem této aplikované poznámky bylo vyvinout robustní metodiku pevnopH sodného gradientu pro cation exchange chromatografii monoklonálních protilátek s použitím kolony BioResolve SCX mAb a technologie AutoBlend Plus. Studie systematicky zkoumala vliv klíčových parametrů (pH, slop gradientu, délka gradientu, průtok, teplota, organické přísady, rozměry kolony) na kvalitu separace.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: trastuzumab, adalimumab, bevacizumab (5 mg/ml) a cetuximab (1 mg/ml) v čisté vodě.
Chromatografický systém:

• ACQUITY UPLC H-Class Bio se silně iontoměnnou kolonkou BioResolve SCX mAb (3 μm) ve formátech 4.6 ×50 mm, 4.6 ×100 mm a 2.1 ×50 mm
• Detekce TUV při 280 nm s titanovou flow cell 5 mm
• Software Empower 3 s AutoBlend Plus Technology
• Mobilní fáze A,B: 100 mM MES (různé pH); C: 1 M NaCl; D: voda

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčová pozorování při optimalizaci metodiky:

• pH mobilní fáze – zásadně ovlivňuje rozlišení kyselých a zásaditých form: zvýšení pH zvyšuje retenční sílu kyselých variant, snižuje zásaditých
• Gradientní slop – měřeno jako mM NaCl/CV: mírnější gradient (menší Δ koncentrace na CV) zlepšuje rozlišení až do praktického limitu, poté již nejsou výrazná zlepšení
• Délka gradientu – delší gradient zjemňuje slop a mírně zvyšuje kapacitu a poměr peak/valley, ale vyžaduje delší analýzy
• Průtok – při konstantním objemu gradientu měl malý vliv na rozlišení; při konstantní délce gradientu zvýšený průtok zjemní gradient a zlepší rozlišení
• Teplota – zvyšuje celkovou retenci podle van’t Hoffovy rovnice, ale nemění významně selektivitu ani poměr peak/valley; doporučuje se stabilní teplota pro reprodukovatelnost
• Organické přísady (isopropanol, methanol) – minimální vliv na selektivitu a rozlišení, indikuje slabou hydrofobní interakci
• Rozměry kolony – zdvojnásobení délky z 50 na 100 mm značně zlepšuje rozlišení při stejném slopu gradientu; užší I.D. kolony trpí vyšší postkolonní disperzí, je však užitečná při omezeném vzorku či nižším průtoku

Přínosy a praktické využití metody

Metodika umožňuje:

• Rychlé a reprodukovatelné oddělení variant náboje mAb
• Efektivní vývoj metod v jednotkách pH a molarity bez složité přípravy mobilních fází
• Snadné přenášení metody mezi formáty kolony a laboratořemi

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může zahrnovat:

• Využití gradientů pH pro jemnější selektivitu
• Volatilní mobilní fáze pro přímou hyphenaci s hmotnostní spektrometrií
• Automatizace a vysokopropustné platformy pro paralelní analýzy
• Modelování a prediktivní návrh metod pomocí experimentálních návrhů

Závěr

Systematická optimalizace parametrů cation exchange chromatografie na koloně BioResolve SCX mAb s AutoBlend Plus představuje efektivní cestu k robustním metodám analýzy variant náboje mAb. Metoda nabízí vysoké rozlišení, reprodukovatelnost a flexibilitu v přenosu mezi formáty a laboratořemi.

Reference

• Khawli LA et al. Charge variants in IgG1. mAbs. 2010;2(6):613–624
• Wang Q et al. Development of pH Gradient Mobile Phase Concentrates for Robust mAb Charge Variant Analysis. Waters Application Note 720006491EN, 2018
• Hlady V, Buijs J. Protein Adsorption on Solid Surfaces. Curr Opin Biotechnol. 1996;7(1):72–77
• Kittelmann J et al. Orientation of Monoclonal Antibodies in IEX Chromatography. J Chrom A. 2017;1510:33–39
• Lauber MA et al. New Particle Technology for Robust Charge Variant Analysis of mAbs. Waters Application Note 720006475EN, 2018
• Fekete S et al. IEX for Biopharmaceutical Characterization. J Pharm Biomed Anal. 2015;113:43–55
• Fekete S et al. Method Development for mAb Charge Variants in CEX, Part I. J Pharm Biomed Anal. 2015;102:33–44