PAMS 2019: Improving LC-MS Separations of Peptides with Difluoroacetic Acid Ion Pairing

Význam tématu

Peptidové mapování je základní pro průzkum struktury bioterapeutik a zajištění jejich kvality. Optimalizace kyselinových modifikátorů mobilních fází přispívá k vyvážené chromatografii a minimalizaci potlačení ionizace v LC-MS. Zavedením difluoroctové kyseliny se snižuje povrchové napětí kapek při elektrosprayi a současně se zlepšuje chromatografická separace bez ztráty citlivosti MS.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat tři běžné kyselinové modifikátory – formovou kyselinu, trifluoroctovou kyselinu a difluoroctovou kyselinu – v peptidech mappingu LC-MS. Použitý model představoval redukovaný a alkylovaný tryptický digest NIST mAb standardu. Vyhodnocena byla chromatografická selektivita, kapacita, citlivost MS a tvorba kovových aduktů.

Použitá metodika

• Separace na ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 a Peptide CSH C18 kolonkách o velikosti částic 1,7 µm a pórech 130 Å při 80 °C
• Gradient založený na 0,1 % formové, difluoroctové nebo trifluoroctové kyselině ve vodní fázi a stejném poměru v acetonitrilu
• UV detekce při 210, 214, 219 nm a plnospektrální MS analýza na Xevo G2 XS QTof s rozsahem 100–2000 m/z

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H Class Bio
• ACQUITY UPLC TUV detektor
• Xevo G2 XS QTof hmotnostní spektrometr
• Software MassLynx a UNIFI

Hlavní výsledky a diskuse

• Trifluoroctová kyselina nabídla nejvyšší chromatografickou separaci, ale značné potlačení MS signálu
• Formová kyselina poskytla maximální citlivost, avšak nejnižší kapacitu separace
• Difluoroctová kyselina se ukázala jako kompromis s výraznou selektivitou a solidní citlivostí v MS mezi formovou a trifluoroctovou kyselinou
• Purifikovaná IonHance DFA minimalizuje obsah sodíku a draslíku pod 100 ppb, čímž snižuje tvorbu kovových aduktů a zlepšuje interpretabilitu spekter
• Použití polymerových kontejnerů dále redukuje riziko kontaminace sodíkem ze skleněných či kovových nádob

Přínosy a praktické využití metody

Použití difluoroctové kyseliny v peptide mappingu umožňuje vyšší peak capacity a stabilní citlivost MS, důkladnou kontrolu aduktů a snadnější vývoj nových metod. Podporuje rychlejší vývoj a QA/QC bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na analýzu subjednotek proteinů a intactních biomolekul
• Integrace s mikrofluidními systémy a plnou automatizaci laboratorních procesů
• Vývoj dalších typů iontových párů s optimalizovanou kyselostí a lipofilitou

Závěr

Difluoroctová kyselina jako modifikátor mobilních fází představuje vyváženou strategii mezi vysokým rozlišením a vysokou MS citlivostí. Její purifikovaná forma zajišťuje minimální kovové adukty a zlepšuje kvalitu spekter, což je klíčové pro biopharmaceutické aplikace.

Reference

• Kellett J., Birdsall R., Yu Y. Application of Difluoroacetic Acid to Improve Optical and MS Performance in Peptide LC UV MS, Waters Technical Brief 2018
• Nguyen J. M., Liu X., Lauber M. A. Low Adduct Peptide LC MS Obtained with IonHance DFA and Certified LDPE Containers, Waters Application Note 2019
• Manuscript in review