FACTORS THAT INFLUENCE THE RECOVERY OF HYDROPHOBIC PEPTIDES DURING LC-MS SAMPLE HANDLING

Význam tématu

Peptidová analýza pomocí LC-MS je základem mnoha biochemických a farmaceutických aplikací. Non-specific binding (NSB) analyzátů k povrchu odběrových nádob může významně snižovat recovery a vést k nesprávné kvantifikaci. Systematické porozumění faktorům ovlivňujícím tyto ztráty je proto klíčové pro dosažení spolehlivých a citlivých výsledků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo identifikovat hlavní experimentální parametry, které ovlivňují recoveries hydrofobních peptidů během vzorkové manipulace před LC-MS analýzou, a navrhnout systematický postup optimalizace podmínek bez použití blokujících činidel. Autoři porovnávali vliv typu odběrové nádoby, složení vzorku, teploty a doby skladování a zbytkového objemu na ztráty peptidů.

Použitá metodika

• Příprava peptidových standardů (melittin, glucagon, teriparatid, desmopresin, insulin) v 80:20 vodě/acetonitrilu s 0,2 % TFA; referenční vzorky doplněné 0,1 % plazmy potkana jako carrier protein.
• Testování různých materiálů odběrových nádob: běžné sklo, polypropylen, speciální nádoby s nízkou hydrofobní adhezí.
• Variace vzorkové matrice: obsah organické fáze (20–80 % acetonitrilu), modifikátory (FA vs. TFA).
• Studie vlivu teploty (4 °C vs. 10 °C), doby skladování (24–75 h) a objemu vzorku na recoveries.
• Vyhodnocení peak area / koncentrace pomocí kalibračních křivek od 50 pg/mL do 100 ng/mL.

Použitá instrumentace

• LC: ACQUITY UPLC I-Class s Fixed Loop injektorem.
• MS: Xevo TQ-S s Universal Source.
• Kolona: CORTECS C18+ 90 Å, 1,6 µm, 2,1 × 50 mm při 55 °C.
• Mobilní fáze A: 0,1 % formiové kyseliny ve vodě; B: 0,1 % formiové kyseliny v acetonitrilu; gradient 15→45 % B za 1,2 min, wash 95 % B za 0,5 min, reekvilibrace 0,6 min.
• Průtok 0,5 mL/min; objem injekce 10 µL.

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky prokázaly, že hydrofobní peptidy:

• Byly nejvíce ztrátové ve skleněných a běžných polypropylenových nádobách, zatímco speciální low-bind materiály zachovaly vyšší recoveries (např. melittin ztráty až 100 % vs. >80 % recovery v low-bind nádobách).
• Vyšší obsah organické fáze v rozmezí 50–80 % acetonitrilu výrazně snižoval NSB, ale nebyl vždy kompatibilní s chromatografií.
• TFA vedla ke zlepšenému chromatografickému rozlišení, avšak způsobovala nižší recoveries ve srovnání s formiovou kyselinou.
• Nižší skladovací teplota (4 °C) a kratší doba (do 24 h) minimalizovaly ztráty; delší expozice a vyšší teploty navyšovaly NSB.
• Vysoký zbytkový objem v nádobách značně omezil množství dostupného vzorku pro analýzu.

Přínosy a praktické využití metody

Navržené postupy poskytují uživatelům LC-MS jasné pokyny, jak minimalizovat ztráty peptidů bez nutnosti přidávat blokující činidla. To vede k lepší citlivosti, reprodukovatelnosti a důvěryhodnosti kvantitativních dat v proteomice, farmaceutickém vývoji a kvalitativních kontrolách.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozvoj nových materiálů s ultra-nízkou adhezí a povrchových úprav, které dále sníží NSB. Integrace automatizovaných systémů skladování se zabudovaným monitoringem teploty a objemu pomůže standardizovat workflow. Aplikace strojového učení pro predikci optimálních podmínek na základě vlastností peptidů představuje perspektivní směr.

Závěr

Peptidové ztráty v odběrových nádobách jsou komplexně ovlivněny materiálem, složením vzorku, teplotou, dobou skladování a objemem. Systematické dodržení navrženého postupu umožňuje dosáhnout vysokých a reprodukovatelných recoveries bez kompromisů v následné LC-MS analýze.

Reference

1. M.C. Jung, Achieving Maximum Protein and Peptide Recovery, Sensitivity, and Reproducibility using QuanRecovery Vials and Plates, Waters White Paper, 720006543EN (2019)
2. Bobaly B., Sipko E., Fekete J., Challenges in liquid chromatographic characterization of proteins, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 1032, 3–22 (2016)
3. Rabe M., Verdes D., Seeger S., Understanding protein adsorption phenomena at solid surfaces, Adv Colloid Interface Sci 162, 87–106 (2011)