FACTORS THAT INFLUENCE THE RECOVERY OF HYDROPHOBIC PEPTIDES DURING LCMS SAMPLE HANDLING

Význam tématu

Optimalizace postupu od přípravy vzorku až po detekci v LC‒MS je klíčová pro citlivou a reprodukovatelnou analýzu biomolekul. Nedostatečná pozornost věnovaná nespecifickým interakcím analytů s povrchy nádob může vést k významným ztrátám peptidů a proteinů, zkreslení kvantitativních výsledků a omezení spolehlivosti metody.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo identifikovat hlavní faktory ovlivňující zotavení hydrofobních peptidů při manipulaci se vzorky před LC‒MS analýzou a navrhnout systematický postup minimalizace ztrát bez použití blokujících činidel, která by mohla negativně ovlivnit následné kroky analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

LC‒MS sestava:

• Chromatograf: ACQUITY UPLC I-Class s pevnou smyčkou injektoru
• Hmotnostní spektrometr: Xevo TQ-S s univerzálním zdrojem
• Kolona: CORTECS C18+, 90 Å, 1,6 µm, 2,1 × 50 mm, 55 °C
• Mobilní fáze A: 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě
• Mobilní fáze B: 0,1 % kyselina mravenčí v acetonitrilu
• Gradient: 15→45 % B za 1,2 min, mytí 95 % B (0,5 min), reekvilibrace (0,6 min)
• Objem injekce: 10 µL

Příprava vzorků peptidů:

• Srovnání roztoků s 0,1 % plazmy potkana (referenční zotavení) vs. bez plazmy
• Variace složení rozpouštědla (podíl vody/acetonitrilu), koncentrace, doba a teplota uchování

Hlavní výsledky a diskuse

1. Volba vhodného kontejneru

• Sklo vede u hydrofobních i bazických peptidů k téměř úplné ztrátě analytu.
• Polypropylenové nízko-vazebné nádoby stále vykazují značné hydrofobní adsorpce.
• Speciálně upravené nádoby (např. QuanRecovery) minimalizují veškeré interakce a zajistí vysoké zotavení.

2. Výběr vzorkového rozpouštědla

• Zvýšený podíl acetonitrilu snižuje hydrofobní adsorpci na plastových površích.
• Vyšší acetonitril však může zhoršit retenci peptidů na chromatografické koloně.
• Opět nejlepší výsledky poskytují inertní kontejnery, kdy není nutné modifikovat složení rozpouštědla.

3. Optimalizace podmínek skladování

• Doba uchování a teplota přímo ovlivňují zotavení peptidů. Nad ~10 °C rychle klesá efektivita v běžných nádobách.
• QuanRecovery nádoby umožnily udržet vysoké zotavení i při pokojové teplotě po 47 h.

Přínosy a praktické využití metody

Implementace systematického přístupu k výběru nádoby, rozpouštědla a skladovacích podmínek zvyšuje:

• Citlivost analýzy díky minimálnímu úbytku analyzovaných peptidů
• Reprodukovatelnost a přesnost kvantifikace
• Flexibilitu workflow bez nutnosti přidávat blokující činidla

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj nových povrchových úprav a materiálů kontejnerů optimalizovaných pro různé třídy biomolekul
• Integrace inertních mikrofluidních systémů pro přímou přípravu a analýzu vzorků
• Automatizace kontroly ztrát vzorku v reálném čase pomocí senzoriky povrchových interakcí
• Rozšíření metodiky na komplexní směsi proteinů, post‐translačních modifikací a biologických matric

Závěr

Nespecifické vazby peptidů k povrchům nádob mohou vážně narušit citlivost a spolehlivost LC‒MS analýz. Systematický postup zahrnující volbu inertního kontejneru, kompatibilního rozpouštědla a optimálních podmínek skladování výrazně zlepšuje zotavení hydrofobních i bazických peptidů bez nutnosti použití blokujících činidel.

Reference

1. Jung M. C. Achieving Maximum Protein and Peptide Recovery, Sensitivity, and Reproducibility using QuanRecovery Vials and Plates. Waters White Paper 720006543EN, 2019.
2. Bobaly B., Sipko E., Fekete J. Challenges in liquid chromatographic characterization of proteins. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 1032, 3–22 (2016).
3. Rabe M., Verdes D., Seeger S. Understanding protein adsorption phenomena at solid surfaces. Adv Colloid Interface Sci 162, 87–106 (2011).