Quantitative Determination of Drugs of Abuse in Human Whole Blood by LC/MS/MS Using Agilent Captiva EMR—Lipid Cleanup

Význam tématu

Rychlé a spolehlivé stanovení drog zneužívání v lidské krvi je klíčové pro forenzní toxicologii i klinické testování. Krev obsahuje buňky, proteiny a lipidy, které mohou narušovat citlivost a reprodukovatelnost LC/MS/MS analýzy. Odstranění lipidů a bílkovin zvyšuje robustnost metody, snižuje iontové potlačení a prodlužuje životnost chromatografického systému.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo demonstrovat použití Agilent Captiva EMR-Lipid 96-well desek ve spojení s in-well precipitací proteinů pro kvantitativní stanovení 24 vybraných drog zneužívání v lidské krevní plazmě pomocí LC/MS/MS. Metoda byla validována třídenními testy přesnosti a opakovatelnosti, limitu kvantifikace (LOQ) i lineárnosti kalibračních křivek.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: 100 μL lidské krve
In-well precipitace proteinů: přidání 500 μL chladné směsi 95:5 ACN/MeOH s 1 % NH4OH, vortex, sedimentace
Čištění lipidů: Agilent Captiva EMR-Lipid 96-well destička, eluce centrifugací nebo pozitivním tlakem, sekundární eluce 200 μL 80:20 ACN/voda
Rekonstrukce: 100 μL 20 mM amonný acetát/ACN, vortex, sonikace, centrifugace
Chromatografie: Agilent 1290 Infinity LC s Poroshell 120 EC-C8 kolonu 100×2,1 mm, 2,7 μm, gradient 10–100 % B za 6 min
Detekce: Agilent 6490 triple quadrupole MS s Jet Stream ESI v pozitivním režimu, dMRM akvizice

Hlavní výsledky a diskuse

Matrix cleanup odstranil více než 99 % fosfolipidů, čímž se minimalizovalo iontové potlačení a usazování nečistot v systému. LOQ se pohyboval od 0,1 do 0,5 ng/mL ve whole blood. Kalibrační křivky vykazovaly R2 >0,995 v rozsahu 0,1–20 ng/mL. Třídenní přesnost (accuracy 100 ± 20 %) a opakovatelnost (RSD <15 %) byly splněny pro všechny analyty a koncentrační hladiny. Oba způsoby eluce poskytly srovnatelné výkony.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje zpracování 96 vzorků za méně než 2 hodiny s vysokou citlivostí a spolehlivostí. Díky účinnému odstranění proteinů a lipidů se výrazně snižuje čas potřebný na čištění HPLC/MS systému a degraduje méně komponent v detekční dráze. Postupy jsou snadno automatizovatelné a vhodné pro forenzní a klinické laboratoře se zvýšenými požadavky na průtok vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozšíření metodiky zahrnuje integraci plně automatizovaných pracovních stanic pro vysokopropustné čištění, aplikaci na nově se objevující psychoaktivní látky, miniaturizaci vzorkovacích objemů pro mikro-SPE i kombinaci s vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrií (HRMS). Vývoj cílených metod ve více analytech a v různých biologických matricích rozšíří uplatnění této technologie v toxikologii.

Závěr

Použití in-well precipitace proteinů následované čištěním Agilent Captiva EMR-Lipid v 96-well formátu je rychlé, účinné a robustní řešení pro kvantitativní stanovení drog zneužívání v lidské krvi. Výsledky prokázaly vynikající přesnost, opakovatelnost, citlivost i přínos v podobě snížení systémových artefaktů, což značně zlepší denní provoz forenzní laboratoře.

Reference

• Mali N.; Karpe M.; Kadam V. A review on biological matrices and analytical methods used for determination of drug of abuse. J. Applied Pharmaceutical Science, 2011, 6, 58–65.
• Saito K.; et al. Analysis of Drugs of Abuse in Biological Specimens. J. Health Science, 2011, 57(6), 472–487.
• Moeller M.R.; Steinmeyer S.; Kraemer T. Determination of drugs of abuse in blood. J. Chromatogr. B, 1998, 713, 91–109.
• Moeller M.R.; Kraemer T. Drugs of Abuse Monitoring in Blood for Control of Driving Under the Influence of Drugs. Ther. Drug Monit., 2002, 24, 210–221.
• Cheong J.C.; et al. GC-MS method for screening and quantification of illicit drugs in urine using SPE and derivatization. J. Sep. Sci., 2010, 33, 1767–1778.
• Øiestad E.L.; et al. Drug Screening of Whole Blood by UPLC-MS/MS. J. Analytical Toxicology, 2011, 35, 280–293.
• Zhao L.; Lucas D. Efficiency of Biological Fluid Matrix Removal Using Agilent Captiva EMR-Lipid Cleanup. Agilent Tech. App. Note, 2017.
• Zhao L.; Lucas D. Quantitative LC/MS/MS Analysis of Drugs in Human Serum with Agilent Captiva EMR-Lipid Cleanup. Agilent Tech. App. Note, 2017.
• Agilent Captiva EMR-Lipid 96-well Plate Protein Precipitation. Agilent Tech. App. Note, 2018.
• Stevens J.; Zhao L. THC and Metabolites in Whole Blood Using Agilent Captiva EMR-Lipid and LC/MS/MS. Agilent Tech. App. Note, 2017.