Protein Precipitation for Biological Fluid Samples Using Agilent Captiva EMR—Lipid 96-Well Plates

Význam tématu

Proteinová precipitace je základní technikou pro přípravu vzorků biologických tekutin před LC/MS/MS analýzou. Odstraňuje velké množství proteinů a díky vhodným sorbentům současně také lipidy. Efektivní čištění vzorků je klíčové pro minimalizaci matrix efektu, zajištění reprodukovatelnosti výsledků a prodloužení provozní doby hmotnostních spektrometrů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem Application Note je podrobně popsat kritické kroky in-well precipitace bílkovin na 96-well destičkách Agilent Captiva EMR—Lipid, zhodnotit vliv volby rozpouštědla, poměru srážecího činidla, přídavků a pořadí dávkování vzorku a porovnat tento postup s tradiční centrifugační precipitací z hlediska časové úspory, účinnosti odstranění matricových interferencí a dopadu na přístroj.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnuje nastavení in-well precipitace a následné filtrační čištění:

• Volba srážecího rozpouštědla: acetonitril (ACN) v poměru 3:1–5:1 nabízí lepší srážení než methanol.
• Přídavky: 1 % kyseliny mravenčí minimalizuje vazbu analytů, ale může zbarvit supernatant hematoglobinem u krve.
• Pořadí dávkování: nejprve vzorek, pak IS, následně srážecí rozpouštědlo pro lepší homogenitu a snížení rizika procházení nerozpuštěných bílkovin.
• Míchání: aktivní vortexování pro objem ≤ 500 µl (1 350 rpm, 1–2 min) nebo pasivní sedimentace 5 min pro vyšší objemy, případně pipetové míchání se širokými špičkami.
• Eluce: filtrace nízkou centrifugační rychlostí (600–700 rpm) či pozitivním tlakem (2–5 psi) až po vypuštění zbytku (3 000 rpm nebo 6–9 psi) a volitelná sekundární eluce 80:20 ACN/voda.

Instrumentace:

• LC/MS/MS systém značky Agilent.
• Agilent Captiva EMR—Lipid 96-well destička s hloubkovou filtrační matricí.
• Centrifuga s adaptéry na 96-well destičky, vakuu­manifold či pozitivní tlakový manifold.
• Multitube vortexér, pipety s reproduktorovými špičkami a širokými koncovkami.

Hlavní výsledky a diskuse

Testy prokázaly, že:

• ACN (poměr 3:1) dosahuje čistého supernatantu a účinnějšího srážení než methanol.
• Přítomnost 5–15 % methanolu zjemňuje sraženiny, ale zvyšuje tlak při filtraci, proto se nedoporučuje překračovat 15 % MeOH.
• Kyselá přídavná složka může zlepšit extrakci některých analytů, ale u celokrevných vzorků způsobuje tmavé zabarvení.
• Změna pořadí dávkování (vzorek → IS → srážecí rozpouštědlo) zlepšuje homogenitu a snižuje riziko průchodu nerozpuštěných proteinů do eluátu.
• Porovnání s tradiční PPT s centrifugací ukázalo úsporu času až 30 %, kompletní odstranění lipofilních interferencí (> 99 % phospholipidů) a snížení doby a spotřeby chladiva na čištění přístroje.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda in-well PPT s Captiva EMR—Lipid destičkami přináší:

• Zjednodušenou a automatizovatelnou protokolaci bez mezidestičkového transferu.
• Vícekriteriální čištění — proteinů i lipidů — pro vyšší citlivost a přesnost měření.
• Nižší riziko kontaminace a vyšší provozní spolehlivost LC/MS/MS systému.
• Zvýšení throughput v high-throughput laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Plná integrace do robotických stanic a laboratorní automatizace.
• Vývoj sorbentů pro současné odstranění dalších typů interferencí (např. polysacharidů, fosfolipidů).
• Miniaturizace a adaptace na mikrofluidní platformy pro snížení spotřeby vzorku a reagencií.
• Optimalizace pro nové detekční systémy a využití metod strojového učení při návrhu protokolů.

Závěr

In-well precipitace bílkovin na Captiva EMR—Lipid 96-well destičce nabízí rychlý, reprodukovatelný a účinný způsob přípravy biologických vzorků pro LC/MS/MS. Správná volba rozpouštědla, poměru, pořadí dávkování a mixovacích postupů je klíčová pro dosažení maximální účinnosti čištění a kvality dat.

Reference

1. Polson et al., Optimization of protein precipitation based upon effectiveness of protein removal and ionization effect in liquid chromatography-tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. B, 2003, 785(2), 263–275.
2. Grant R., Solutions Based Extraction Techniques, prezentace Sample Preparation ASMS Fall Workshop, 2016.
3. Zhao L., Lucas D., Agilent Technologies Application Note, 5991-8006EN, 2017.
4. Lucas D., Zhao L., Agilent Technologies Application Note, 5991-7956EN, 2017.
5. Stevens J., Zhao L., Agilent Technologies Application Note, 5991-8635EN, 2017.
6. Zhao L., Lucas D., Agilent Technologies Application Note, 5991-8007EN, 2017.