Analysis of Underivatized Amino Acids by LC/MS for Bioreactor Cell Culture Monitoring

Význam tématu

Hydrofobní interakce ve zpětné fázi je pro polární aminokyseliny často nedostatečná, což komplikuje jejich stanovení v bioreaktorových médiích. Metoda HILIC spojená s hmotnostní spektrometrií v negativním ionizačním režimu umožňuje přímou analýzu neodvozených aminokyselin, sledování spotřeby živin a tvorby odpadních produktů buněčných kultur bez časově náročné derivatizace.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a ověřit robustní LC/MS metodu pro současné stanovení aminokyselin, glukózy a laktátu ve vzorcích fermentačních médií. Metoda byla otestována na vzorcích ze dvou typů bioreaktorů (hollow fiber a rolling bottle) kultivujících CHO buňky, přičemž se hodnotila separační kapacita, opakovatelnost a schopnost sledovat metabolity v reálném čase.

Použitá metodika

Vzorky buněčné kultury byly zředěny 1:4 50% ACN, separovány na kolóně Agilent AdvanceBio MS Spent Media HILIC (2,1×150 mm) při 30 °C s gradientem mobilní fáze A (10 mM acetátu při pH 9 ve vodě) a B (10 mM acetátu v ACN) od 90 % B na 20 % B za 13 minut a návratu do 90 % B do 25 minut. Průtok byl 0,25 mL/min, objem injekce 1 µL. MS detekce probíhala na Agilent 6545 Q-TOF, ESI negativní režim, m/z 50–1 000, vysoká pH stabilita zajišťuje sledování aminokyselin a metabolit ve stejném běhu.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II binary pump, vial sampler a multikolónový termostat
• Agilent 6545 Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometer
• Agilent Jet Stream ESI zdroj
• MassHunter workstation B.08.00

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila rozlišení a kvantifikaci více než 20 aminokyselin, včetně isobarů leucinu a isoleucinu (baseline separace s rozlišením 1,6). Opakovatelnost mezi injekcemi byla vynikající. Aplikace na vzorcích z hollow fiber a rolling bottle reaktorů prokázala sledování spotřeby glukózy a aminokyselin a akumulaci laktátu. Zvýšená koncentrace glutaminu ve spiked médiu se projevila vyšším signálem v počátečních vzorcích.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace derivatizace zkracuje dobu analýzy a snižuje spotřebu chemikálií
• Možnost současného sledování aminokyselin, glukózy a laktátu ve stejném běhu
• Vysoká opakovatelnost a citlivost vhodná pro kontrolu bioprodukčních procesů

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace online odběru vzorků a automatizovaných přípravných stanic pro real-time monitoring, využití vysokoprůtokových kolón pro zvýšení kapacity analýz, kombinace s technikami datové analýzy založené na strojovém učení pro rychlou interpretaci výsledků a rozšíření panelu analyzovaných metabolit.

Závěr

Vyvinutá HILIC-MS metoda v negativním ionizačním režimu pro neodvozené aminokyseliny poskytuje rychlý, citlivý a reprodukovatelný přehled o složení bioreaktorových médií. Je vhodná pro rutinní monitoring fermentačních a buněčných kultur a podporuje optimalizaci biotechnologických procesů.

Reference

Agilent Technologies Application Note 5991-8816EN, 2018