Analysis of Underivatized Amino Acids and Metabolites in Cell Culture Media by HILIC-LC/MS

Význam tématu

Monitoring polaritních metabolitů v buněčných médiích přispívá k lepší kontrole a optimalizaci biochemické produkce v bioreaktorech.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem je vyvinout od derivatizace nezávislou HILIC-LC/MS metodu pro stanovení aminokyselin, polyaminů a B vitamínů v médiích buněčných kultur a pro hodnocení jejich vlivu na produkci monoklonálních protilátek (mAb). Studie je rozdělena na dva projekty: optimalizaci složení média a sledování spotřeby živin a exkrece odpadních produktů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky spojená média CHO buněk byla připravena ředěním s acetonitrilem nebo mobile fází a následnou centrifugací.

• Chromatografické systémy: Agilent 1260 Infinity II BioInert LC s Agilent 6230 TOF a Agilent 1290 Infinity II LC s Agilent 6545XT QTOF.
• Kolony: AdvanceBio MS Spent Media 2,1 × 100 mm (40 °C) a 2,1 × 150 mm (30 °C).
• Mobile fáze: 200 mM ammonium formiát pH 3 v kombinaci vody a acetonitrilu; 100 mM ammonium acetát pH 9 v podobném složení.
• Detekce: MS v pozitivním i negativním iontovém módu bez potřeby derivatizace.

Hlavní výsledky a diskuse

Projekt 1 prokázal úplné rozlišení isomerů leucinu/isoleucinu a kvantifikaci aminokyselin a B vitamínů. Media 2 vykazovalo vyšší hladiny aminokyselin jako glutamin a až trojnásobný mAb titer ve srovnání s médiem 1.
Projekt 2 sledoval kinetiku spotřeby aminokyselin, glukózy a exkrece laktátu. Zvýšený glutamin v bioreaktoru s dutými vlákny odráží nutnost jeho doplňování kvůli nestabilitě v komerčním médiu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí rychlou, spolehlivou a bezderivatizační analýzu širokého spektra polaritních metabolit pro optimalizaci média, dynamický monitoring metabolismu a korelaci s produkcí mAb.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace HILIC-LC/MS do on-line monitoringu buněčných kultur, rozšíření na komplexní metabolomické studie a využití strojového učení pro predikci spotřeby živin a produkčních parametrů.

Závěr

Navržená HILIC-LC/MS metoda představuje flexibilní, citlivé a derivatizace nezávislé řešení pro komplexní analýzu buněčných médií a optimalizaci biofarmaceutické výroby.

Reference

1. Dumont E.; Vandenheede I.; Sandra P.; Sandra K. mAb Titer Analysis with the Agilent Bio-Monolith Protein A Column. Agilent Technologies Application Note. 2014.