A Comprehensive Approach for Monoclonal Antibody N-linked Glycan Analysis from Sample Preparation to Data Analysis

Význam tématu

Glykosylace je klíčovým post-translačním procesem u monoklonálních protilátek, ovlivňuje jejich biologickou aktivitu, stabilitu, farmakokinetiku a imunogenicitu. Přesná charakterizace N-glykanů je zásadní pro kontrolu kvality bioterapeutik a biosimilárních produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ukázat integrované řešení pro analýzu N-vazebných glykosidů mAb od přípravy vzorků až po vyhodnocení dat. Autoři představili automatizovanou workflow založenou na Agilent AssayMAP Bravo, kapalinové chromatografii spojené s fluorescenční detekcí a vysokorozlišeným MS/Q-TOF, včetně softwarové podpory MassHunter BioConfirm.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala enzymatické uvolnění N-glykanů pomocí PNGase F, jejich očistu a značení fluorescenčním činidlem InstantPC, následné chromatografické dělení na AdvanceBio Glycan Mapping kolóně a detekci kombinací LC-FLD a LC-MS/Q-TOF.

Instrumentace:

• Agilent AssayMAP Bravo (G5542A) pro automatizovanou přípravu vzorků
• Agilent 1290 Infinity II LC s AdvanceBio Glycan Mapping kolónou (2.1×100 mm, 1.8 µm)
• Agilent 1260 Infinity fluorescenční detektor (λEx = 285 nm, λEm = 345 nm)
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual Jet Stream ESI zdrojem
• Software MassHunter BioConfirm B.09.00 včetně GlycoPrep-plus Rapid N-Glycan Workflow a PCD databáze

Hlavní výsledky a diskuse

• FLD chromatogramy ukázaly rozlišení více než 15 hlavních N-glykanových forem u NISTmAb, včetně G0F, G1F, G2F a manózových izomerů.
• MS analýza prokázala vynikající ionizační efekt InstantPC značení, detekci dvojitě nabitých iontů a jejich sodíkových a draslíkových aduktů s přesností hmotnostního měření.
• Software BioConfirm umožnil automatickou identifikaci glykanů pomocí Find by Formula a generování reportů s přiřazenými vzorci, retencemi a relativními abundancemi.
• Porovnání kvantifikace FLD vs. MS u vzorků CHO mAb1 potvrdilo konzistentní relativní poměry top glykanů s maximální odchylkou pod 5 %.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Výrazné zvýšení průchodnosti a reproducibility díky automatizaci přípravy vzorků.
• Vysokou citlivost a vysoké rozlišení glykanů pro spolehlivou kontrolu kvality bioterapeutik.
• Flexibilitu v kvantifikaci přes FLD nebo MS s možností přesného přiřazení hmotnostních špiček.
• Uživatelsky přívětivé generování komplexních analytických reportů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozvoj multiplexních fluorescenčních a hmotnostních značek pro komplexní glycome analýzu.
• Integrace strojového učení pro automatizované rozpoznávání vzorů v glykanových profilech.
• Rozšíření workflow na O-N-glykanové a jiné posttranslační modifikace.
• Škálovatelnost metody pro klinické a průmyslové nasazení v reálném čase.

Závěr

Implementované Agilent řešení pro analýzu N-glykanů monoklonálních protilátek představuje robustní, citlivou a vysoce průchodnou platformu od přípravy vzorků až po finalizaci dat. Automatizace, přesné označení InstantPC a výkonná MS/Q-TOF detekce s softwarem BioConfirm usnadňují spolehlivou charakterizaci glykosylace a podporují kvalitu bioterapeutik.

Reference

• Rademacher TW, Williams P, Dwek RA. Agalactosyl glycoforms of IgG autoantibodies are pathogenic. PNAS. 1994;91(13):6123–6127.
• Anumula KR. Advances in fluorescence derivatization methods for HPLC analysis of glycoprotein carbohydrates. Anal Biochem. 2006;350(1):1–23.
• Agilent Technologies. N-Glycan Analysis of mAbs and Other Glycoproteins with UHPLC and Fluorescence Detection. Publ. 5991-5253EN.
• Agilent Technologies. Comparison of Relative Quantification of Monoclonal Antibody N-glycans Using Fluorescence and MS Detection. Publ. 5991-6958EN.
• Agilent Technologies. Analysis of Monoclonal Antibody N-glycans by Fluorescence Detection and Robust Mass Selective Detection Using the Agilent LC/MSD XT. Publ. 5991-8071EN.