Automated Workflow for Monoclonal Antibody N-Linked Glycan Analysis

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) patří k nejvýznamnějším biologickým léčivům, zejména v onkologii a imunoterapii. Glykozylace Fc části ovlivňuje stabilitu, farmakokinetiku a efektorové funkce protilátek. Kontinuální a spolehlivý monitoring N-vázaných glykánů je klíčový jak ve fázi vývoje klonů, tak ve výrobě a kontrole kvality finálních produktů.

Cíle a přehled studie/článku

Cílem aplikace bylo navrhnout a ověřit plně automatizovaný pracovní postup pro uvolnění, značení a čištění N-vázaných glykánů z mAb pomocí zařízení Agilent AssayMAP Bravo a kitu GlykoPrep InstantPC. Studie zahrnovala analýzu 24 vzorků protilátek v jediném běhu a jejich identifikaci a kvantifikaci pomocí Agilent 1290 Infinity II LC spojeného s 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF a fluorescenční detekcí.

Použitá metodika a instrumentace

Automatizovaný protokol obsahuje tyto kroky:

• Imobilizace a denaturace protilátek na RX cartridgích.
• Enzymatické uvolnění N-glykánů pomocí PNGase F při 45 °C.
• Okamžité značení glykánů barvivem InstantPC.
• Čištění značených glykánů na CU cartridgích.
• Přímá analýza vzorků LC/FLD a LC/Q-TOF bez nutnosti další purifikace.

Klíčová přístrojová sestava:

• Agilent AssayMAP Bravo s Agilent Protein Sample Prep Workbench SW.
• GlykoPrep InstantPC kit (deglycosylační, značící a cleanup moduly).
• Agilent 1290 Infinity II LC se systémem FLD (λEx = 285 nm, λEm = 345 nm).
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s dual Jet Stream zdrojem.
• AdvanceBio Glycan Mapping kolona (HILIC, 2.1×150 mm, 1.8 µm).

Hlavní výsledky a diskuse

Ve studii bylo identifikováno 22 N-glykánových struktur, z toho 17 u kontrolní human IgG pro kalibraci retenčních časů a přesných hmotností. Nejběžnějšími glykany byly fukosylované oligosacharidy G0F, G1F a G2F, které tvořily přes 90 % celkového obsahu u všech zkoumaných mAb. Reprodukovatelnost workflow byla vysoká, CV jednotlivých glykánů se pohybovalo pod 10 %.
Porovnání kvantifikace pomocí MS a FLD ukázalo velmi dobrou shodu (rozdíly do 2 % pro většinu glykánů, maximálně do 5 %). Automatizace umožnila přípravu 24 vzorků během cca 3 hodin bez ruční manipulace s jednotlivými nádobami, přičemž výsledné vzorky stačilo pouze injektovat do LC/FLD nebo LC/Q-TOF.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný postup přináší řadu výhod:

• Výrazné zkrácení doby přípravy a zvýšení throughput.
• Minimalizace variability díky reprodukované pipetáži a řízeným podmínkám.
• Walk-away režim zvyšuje kapacitu laboratoře a snižuje riziko kontaminace.
• Vysoká citlivost a přesnost kvantifikace glykanů v MS i FLD režimu.
• Standardizace postupu vhodná pro screening klonů i rutinní QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj směřuje k plné integraci nových kitů Agilent Gly-X InstantPC na platformu Bravo, k dalšímu zkrácení času enzymatické digesce a značení, včetně on-matrix postupu bez nutnosti sušení. Dále se předpokládá rozšíření interních databází glykánů pro rychlejší a automatické vyhodnocování v softwaru BioConfirm a zavádění AI-podpořených algoritmů pro predikci a identifikaci neobvyklých glykánových forem.

Závěr

Implementace automatizovaného workflow pro uvolnění, značení a čištění N-glykánů z monoklonálních protilátek výrazně zvyšuje efektivitu a reprodukovatelnost analýzy. Kombinace Agilent AssayMAP Bravo, InstantPC kitu a pokročilých LC/FLD a LC/Q-TOF systémů poskytuje spolehlivou platformu vhodnou pro vývoj bioterapeutik i rutinní kontrolu kvality.

Reference

1. Arnold J. N. et al. The Impact of Glycosylation on the Biological Function and Structure of Human Immunoglobulins. Annu. Rev. Immunol. 2007, 25, 21–50.
2. Agilent Technologies. GlykoPrep-plus Rapid N-Glycan Sample Preparation with InstantPC Automated on AssayMAP Technology, GPPNG-PC Instruction Manual.
3. Oscar P. et al. Analysis of Monoclonal Antibody N-glycans by Fluorescence Detection and Robust Mass Selective Detection Using the Agilent LC/MSD XT. Application Note 5991-8071EN, 2017.
4. Wong D. L. et al. A Comprehensive Approach for Monoclonal Antibody N-linked Glycan Analysis from Sample Preparation to Data Analysis. Application Note 5991-8550EN, 2017.
5. Yan J. et al. Comparison of Common Fluorescent Labels for LC/MS Analysis of Released N-Linked Glycans. Application Note 5994-0942EN, 2019.
6. Agilent Technologies. N-Glycan Analysis: Better Together. Brochure 5994-1647EN, 2020.
7. Agilent Technologies. Agilent AdvanceBio Gly-X N-Glycan Prep with InstantPC Kit: Simplified Workflow for Rapid FLD/MS Glycan Analysis. Brochure 5994-0918EN, 2019.
8. Yan J.; Jones A. Streamlined Workflows for N-Glycan Analysis of Biotherapeutics Using Agilent AdvanceBio Gly-X InstantPC and 2-AB Express Sample Preparation with LC/FLD/MS. Application Note 5994-1348EN, 2019.