Profiling Glycosylation of Monoclonal Antibodies at Three Levels Using the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q‑TOF

Význam tématu

Glykozylace monoklonálních protilátek zásadně ovlivňuje jejich terapeutické vlastnosti včetně biologické aktivity, stability a imunogenicity. S rostoucím počtem schválených mAb produktů se zvyšuje potřeba spolehlivých a kvantitativních metod pro monitorování glykana během vývoje a výroby biotechnologických léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyhodnotit tři hlavní úrovně LC/MS workflow pro analýzu glykozylace mAb pomocí Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF a doplňující instrumentace. Konkrétně šlo o: intactní protilátku, její redukované podjednotky (HC, LC) a uvolněné N-glykanové struktury. Výsledky byly ověřeny na referenčním NISTmAb standardu.

Použitá metodika a instrumentace

Pro všechny čtyři analyzační úrovně proběhly preparativní a detekční kroky:

• Sample prep: Agilent AssayMAP Bravo platforma pro rychlou a reprodukovatelnou manipulaci s objemy.
• Chromatografie: Agilent 1290 Infinity II LC s PLRP-S (pro intactní mAb a podjednotky) a AdvanceBio Glycan Mapping (pro uvolněné glykany).
• Detekce: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual Jet Stream zdrojem, propojený s fluorescence detektorem (λEx 285 nm, λEm 345 nm) pro FLD analýzu glykana.
• Software: Agilent MassHunter BioConfirm B.09.00 pro automatizovanou dekonvoluci spekter, identifikaci a relativní kvantifikaci glykoform.

Hlavní výsledky a diskuse

Intactní mAb workflow prokázalo schopnost rychle identifikovat a kvantifikovat hlavní glykoformy (G0F, G1F, G2F) s vysokou opakovatelností (SD <1 %). Analýza redukovaných podjednotek (HC) odhalila srovnatelnou distribuci glykoform a umožnila selektivní kvantifikaci jednotlivých variant. Workflow pro uvolněné N-glykany s InstantPC značením přineslo nad 15 detekovaných struktur, včetně separace izomerů G1F, a poskytlo citlivé a reprodukovatelné výsledky jak FLD, tak EIC MS.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká flexibilita čtyř úrovní analýzy umožňuje pokrytí od celých molekul až po uvolněné glykany.
• Automatizace přípravy a zpracování dat zrychluje workflow a minimalizuje chyby obsluhy.
• Kvantitativní přesnost a vysoké rozlišení Q-TOF přispívají ke konzistentní kontrole kvality bioprocesů.
• Integrovaný software zjednodušuje identifikaci glykoform a správu glykanové databáze.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj se může soustředit na miniaturizaci a paralelní zpracování vzorků, implementaci vyššího rozlišení hmotnostních analyzátorů a využití pokročilých databází glykanových struktur. Integrace umělé inteligence pro predikci glykoform a plně automatizované QC platformy slibuje další zvýšení rychlosti a spolehlivosti biopharma analytiky.

Závěr

Popsaná platforma kombinuje čtyři úrovně LC/MS analýzy pro komplexní charakterizaci glykozylace mAb. Díky automatizované přípravě vzorků, špičkové chromatografii a Q-TOF detekci nabízí metodika rychlou, citlivou a vysoce reprodukovatelnou kvantifikaci glykoform v biopharmaceutickém výzkumu i výrobě.

Reference

1. Rademacher T.W.; Williams P.; Dwek R.A. Agalactosyl glycoforms of IgG autoantibodies are pathogenic. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994, 91, 6123–6127.
2. Agilent Technologies. Precise Characterization of Intact Monoclonal Antibodies by the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF; Publ. No. 5991-7813EN.
3. Agilent Technologies. Making Peptide Mapping Routine with the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF; Publ. No. 5991-7815EN.
4. Agilent Technologies. A Comprehensive Approach for Monoclonal Antibody N-linked Glycan Analysis from Sample Preparation to Data Analysis; Publ. No. 5991-8550EN.
5. Agilent Technologies. Separation of IgG Glycopeptides using HILIC-LC-MS in Comparison to RP-LC-MS; Publ. No. 5991-4903EN.