LC/MS/MS Method for Quantitative Determination of Ethinyl Estradiol in Human Plasma

Význam tématu

Stanovení ultranízkých koncentrací syntetického estrogenu ethinylestradiolu v lidské plazmě je klíčové pro farmakokinetické studie, terapeutické monitorování a toxikologická hodnocení. Vysoká citlivost a selektivita analýzy umožňuje detekovat stopová množství účinné látky, sledovat biodistribuci a vyhodnocovat bezpečnostní profily kontraceptiv i léčivých přípravků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a validovat vysoce citlivou kvantitativní metodu pro měření ethinylestradiolu (EE) v lidské plazmě s dolní mezí stanovitelnosti (LLOQ) 1,0 pg/mL. Použitá instrumentace zahrnuje UHPLC Nexera spojenou s hmotnostním spektrometrem LCMS-8040 ve vícečetném monitorovacím režimu (MRM).

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorku:

• Odběr 750 µL plazmy a okyselení 0,1 M HCl.
• Tekutá extrakce směsí hexanu a MTBE (50:50 v/v), odpaření organické fáze pod dusíkem.
• Derivatizace pozůstatku EE s dansylchloridem v pufru pH 11 při 60 °C (15 min) pro zlepšení ionizace.
• Čištění pomocí SPE kazety Sola CX (pre-kondice, praní 5 % a 20 % metanolu, eluace ACN/2-propanol 90:10 v/v).

Instrumentální podmínky:

• Kolona: Purospher star RP18, 100 × 2,1 mm, 2,0 µm.
• Mobilní fáze A: 0,1 % formiová kyselina ve vodě; B: acetonitril; gradient 65 % B → 85 % B (2 min) → 90 % B (2,5 min) → 95 % B (1 min), návrat na 65 % B a ekvilibrace.
• Průtok 300 µL/min, teplota kolony 35 °C.
• ESI positive, MRM přechody 529,90 → 171,10 pro EE a 534,00 → 171,10 pro IS.
• Hmotový spektrometr LCMS-8040 (triple quadrupole), UHPLC Nexera.

Hlavní výsledky a diskuse

LLOQ metody bylo stanoveno na 1,0 pg/mL (CV 15,1 %, n = 6). Linearita v rozsahu 1,0–200,0 pg/mL dosahovala regresního koeficientu R2 = 0,9988 (vážená kalibrace 1/x2). Přesnost QC vzorků (% CV) se pohybovala mezi 3,3 a 9,8 %, přesnost (bias) průměrně 96,6 %. Průměrná recovery EE dosáhla 64,5 % a byla konzistentní ve všech úrovních QC. Efektivní odstranění fosfolipidů a sesterestradiolů z bio matice bylo potvrzeno absencí interferencí v plazmě blank.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutá metoda umožňuje:

• Detekci ethinylestradiolu na úrovních pg/mL s malým objemem plazmy (750 µL).
• Vysoce selektivní kvantifikaci díky derivatizaci a MRM detekci.
• Robustní odstraňování biologických interferencí (dvoustupňová příprava).
• Uplatnění v farmakokinetice, léčebném monitorování, toxikologii a klinickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

1. Integrace automatizované extrakce a derivatizace pro vyšší propustnost.
2. Použití nových derivatizačních činidel zlepšujících ionizaci.
3. Vyšší rozlišení a citlivost u orbitrap nebo TOF hmotových spektrometrů.
4. Multiplexní analýzy několika estrogenů v jednom běhu.
5. Miniaturizace a mikrosystémové přístupy pro klinické aplikace.

Závěr

Popsaná UHPLC-MS/MS metoda kombinuje účinnou dvoustupňovou přípravu vzorků s derivatizací a selektivní MRM detekcí, což umožňuje kvantifikaci ethinylestradiolu v plazmě již od 1,0 pg/mL. Vysoká linearita, přesnost a reprodukovatelnost potvrzují vhodnost postupu pro farmakokinetické studie a klinické aplikace.

Reference

• Drug Discov Ther. 2007;1(2):108–118.
• Rapid Commun Mass Spectrom. 2004;18:1621–1628.
• Biomed Chromatogr. 2004;18:414–421.
• J Chromatogr B. 2005;825:223–232.