Analysis of free plasma ethinyl estradiol

Význam tématu

Quantitativní stanovení volného ethinylestradiolu v plazmě s ultra­citlivou detekcí v hladinách od 5 pg/mL má klíčový význam pro bioanalytiku, klinické studie a farmakokinetické sledování hormonálních přípravků. Metoda minimalizuje matrix efekty, zvyšuje spolehlivost výsledků a umožňuje vysokopropustné laboratorní zpracování biologických vzorků.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje vývoj a validaci LC-MS/MS metody pro stanovení ethinylestradiolu v lidské plazmě využívající novou SPE fázi SOLA 30 mg SCX. Hlavní cíle:

• Vytvořit vzorkovací protokol pomocí SOLA SCX SPE 96-well formátu
• Optimalizovat rychlou UHPLC separaci na Hypersil GOLD Vanquish C18 koloně
• Zajistit citlivou a reprodukovatelnou detekci ethinylestradiolu pomocí TSQ Altis MS

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation:

• Spikování plazmy (1 mL) středními a vnitřními standardy
• Hydrolýza a nafiltrace vzorku, doplnění pH 4,5
• SPE extrakce na SOLA SCX 30 mg 96-well destičce (kondice MeOH, voda; náplach vodou/MeOH; eluace MeOH)
• Sušení N₂ při 50 °C; rekonstrukce v NaHCO₃ pH 10,5
• Derivatizace dansylchloridem (1 mg/mL) při 60 °C / 30 min

UHPLC–MS/MS podmínky:

• UHPLC systém Vanquish Horizon s Hypersil GOLD Vanquish C18 (100×2,1 mm, 1,9 µm)
• Isokratická eluce 80 % acetonitrilu; doba analýzy 1,5 min; teplota 30 °C; průtok 0,75 mL/min; injekce 10 µL
• TSQ Altis TrQ ve pozit. režimu H-ESI (spray +4500 V); zdroj 350 °C; vaporizer 300 °C; průtoky plynů 18/24/1 Arb
• SRM přechody: ethinylestradiol-dansyl 530→171 (CE 35,5 V); IS-d7 537→171

Hlavní výsledky a diskuse

Linearita a přesnost:

• Rozsah kalibrace 5–200 pg/mL, R² = 0,993
• Bias kalibračních bodů od –10,6 % do +10,1 %

Kontrolní vzorky (LLOQ, LQC, MQC, HQC):

• Bias < ±15 %; CV ≤ 6,1 %

Matrix efekty a recovery:

• IS-normalizovaný matrix factor 1,03 (minimální potlačení/zvýšení signálu)
• Recovery analýtu 91,3 %; IS 88,4 %

Diskuse:
Derivatizace dansylovou skupinou zlepšuje ionizaci a citlivost. SOLA SCX mixed-mode sorbent kombinuje reverzní fázi a kationtovou výměnu, čímž selektivně odstraňuje interferující základní složky plazmy a zabraňuje zanášení SPE matricí.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje vysokou citlivost a robustnost analýzy volného ethinylestradiolu v plazmě při minimálních matrix efektech a vysokém průtoku vzorků. Je vhodná pro biofarmaceutické studie, terapeutické monitorování a QA/QC v produkci hormonálních léků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další automatizace a robotizace SPE a derivatizace pro ultra vysokopropustné formáty
• Integrace mikrofluidických modulů pro snížení objemů vzorků
• Vývoj nových selektivních sorbentů a derivatizačních činidel pro steroidní sloučeniny
• Kombinace s HRMS pro rozšířenou selektivní a ­pravděpodobnostní detekci metabolitů

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda s dvoufázovou SPE extrakcí a derivatizací dosahuje citlivosti 5 pg/mL, vysoké přesnosti i reprodukovatelnosti a minimalizuje matrix efekty. SOLA SCX 30 mg SPE destička značně zjednodušuje a zrychluje přípravu plazmových vzorků, čímž podporuje náročné biofarmaceutické aplikace.

Reference

1. Wright K. P., Johnson J. V. Evaluation of extended and continuous use oral contraceptives. Therapeutics and Clinical Risk Management, 2008, 4(5), 905–911.