LC-MS/MS analysis of the new antioxidant identifed from a soft-body extract of Crassostrea gigas

Význam tématu

Oxidační stres v mozku je spojen s nespavostí a neurodegenerativními onemocněními. Antioxidanty schopné proniknout hematoencefalickou bariéru (HEB) jsou klíčové pro ochranu centrálního nervového systému. Z měkkých tkání ústřice Crassostrea gigas byl identifikován nový silný antioxidant 3,5-dihydroxy-4-methoxybenzylalkohol (E6), který vykazuje vyšší účinnost než α-tokoferol či kyselina askorbová.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout citlivou a selektivní LC–MS/MS metodu pro kvantifikaci E6 a ověřit jeho schopnost proniknout HEB in vitro prostřednictvím BBB kitu a in vivo v myším modelu po orálním podání.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: syntetický standard E6 a extrakty z Crassostrea gigas
• Chromatografie: Prominence HPLC se stacionární fází Shim-pack VP-ODS (2,0 × 150 mm, 5 μm), mobilní fáze A (0,05 % kyselina octová), B (acetonitril), gradient 5–100 % B (0–12 min), 0,21 mL/min, 40 °C
• Detektor: LCMS-8040 triple kvadrupol, ESI negativní mód (−3,5 kV), MRM přechody 169 > 154 (quant), 169 > 137, 169 > 125 (referenční), CE 14–24 V
• In vitro BBB test: BBB kit s endotelovými buňkami, pericyty a astrocyty, E6 100 μM
• In vivo farmakokinetika: orální podání E6 myším, odběry plazmy a mozkové tkáně 10–360 min po podání

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizovaný MRM režim dosáhl detekčního limitu 1 ng/mL a lineárního rozsahu 1–1000 ng/mL (R2 > 0,99).
• In vitro test ukázal transport E6 na abluminalní stranu BBB kitu, potvrzující schopnost proniknout HEB.
• In vivo: maximální hladina E6 v plazmě byla 10 min po podání, v mozku pak vrcholila přibližně po 30 min a následně poklesla.
• Kontrolní vzorky prokázaly, že E6 není endogenně přítomen v organismu myší.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoce citlivé stanovení E6 umožňuje přesnou farmakokinetickou a toxikologickou analýzu nových antioxidantů.
• Metoda podporuje vývoj neuroaktivních léčiv ověřením průniku HEB.
• Postup lze adaptovat na screening přírodních i syntetických sloučenin s antioxidačními vlastnostmi.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření výzkumu na lidské modely a klinické studie E6.
• Vývoj analogů E6 s vylepšenou stabilitou a biodostupností.
• Integrace vysokorozlišujících MS technik pro detailní metabolomiku.
• Automatizace přípravy vzorků a online propojení HPLC–MS systémů.

Závěr

Metoda LC–MS/MS pro stanovení E6 nabízí vysokou citlivost, selektivitu a prokázala schopnost proniknout HEB jak in vitro, tak in vivo. Otevírá možnosti pro další vývoj neuroprotektivních antioxidantů.

Reference

• Mitsugu Watanabe, Kazuyo Fukushima, Jun Watanabe: LC–MS/MS analysis of the new antioxidant identified from a soft-body extract of Crassostrea gigas, ASMS 2015, WP 103.