Development of high speed CYP cocktail inhibition assay using UHPLC-MS/MS

Význam tématu

Cytochrom P450 (CYP) hraje klíčovou roli v eliminaci cizorodých látek a stanovení jeho inhibice je zásadní pro prevenci nežádoucích interakcí mezi léky. Rychlá a spolehlivá analýza CYP aktivit je nezbytná ve vývoji nových léčiv a hodnocení rizik drogových interakcí.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout vysoce rychlou verzi CYP cocktail inhibičního testu pomocí ultrarychlé kapalinové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií (UHPLC-MS/MS) na systému Nexera a LCMS-8080. Hlavním požadavkem bylo zkrácení doby analýzy z 7 minut na 1 minutu bez ztráty kvality dat (LOQ, linearita, opakovatelnost).

Použitá metodika a instrumentace

Popis přípravy vzorku:

• Incubace human liver microsomů (0,1 mg/mL) v pufru (50 mmol/L fosfát, pH 7,4) s MgCl2 a enzymy (isocitrátní dehydrogenáza, NADPH).
• Po 10min přidání NADPH a následných 10min reakce při 37 °C.
• Zastavení reakce acetonitrilem, centrifugace a odběr supernatantu.

Analyzované substance a jejich metabolity:

• Resorufin Ethyl Ether → Resorufin
• Bufuralol → 1′-Hydroxy Bufuralol
• Mephenytoin → 4′-Hydroxy Mephenytoin
• Nifedipine → oxidovaný Nifedipin
• Tolbutamide → Hydroxy Tolbutamide

Instrumentace:

• UHPLC: Shim-pack XR-ODSII (30×1,5 mm, 2,2 µm), mobilní fáze A (0,05 % kyselina mravenčí ve vodě) / B (acetonitril), gradient 5–80 % B během 0,6 min, tok 0,8 mL/min, teplota 50 °C.
• MS/MS: LCMS-8080, ESI pozitivní i negativní mód, MRM přechody pro každou látku.

Hlavní výsledky a diskuse

Nová metoda dosáhla sedminásobného zvýšení propustnosti (1 min cyklus vs. 7 min). Chromatogramy prokázaly dostatečné rozlišení všech pěti metabolitů během 1 min. Kalibrační křivky v matici vykázaly r2 > 0,996 a dynamické rozmezí 0,6–300 nmol/L (oxidovaný nifedipin až 1000 nmol/L). Opakovatelnost (%RSD) byla u všech analytů pod 10 % při LOQ. Kvantifikace reálného vzorku potvrdila spolehlivé koncentrace metabolitů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje vysokopropustné screenování CYP inhibice v rané fázi výzkumu léčiv, zkracuje dobu analýzy a šetří provozní náklady bez kompromisu na analytické parametry.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace s automatizovanými platformami pro vysokoproduktivní screening, rozšíření panelu CYP izoenzymů, kombinace s in silico modelováním interakcí a aplikace v personalizované farmacii.

Závěr

Vyvinutá UHPLC-MS/MS metoda na systému Nexera a LCMS-8080 výrazně zkrátila dobu analýzy CYP cocktail inhibičních testů na 1 minutu při zachování vysoké kvality dat, což otevírá nové možnosti v preklinickém hodnocení lékových interakcí.

Reference

1. Hirano I, Kawashima M, Asano N, Arakawa K, Hayakawa Y. Development of high speed CYP cocktail inhibition assay using UHPLC-MS/MS. ASMS 2013, W02-040; Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan.