High-Throughput Analysis of Drug Metabolites Using a Triple Quadrupole LC-MS/MS System

Význam tématu

Rychlá a spolehlivá kvantifikace metabolitů léků je klíčová v preklinickém vývoji (ADME/Tox) a farmakokinetických (PK) studiích, kde je nutné zpracovat velké objemy vzorků v krátkém čase. Zvýšení propustnosti analytických laboratorí znamená zrychlení rozhodovacích cyklů ve vývoji léčiv a snížení nákladů na analýzu. Prezentovaná metoda demonstruje, jak lze kombinací moderní UHPLC a triple kvadrupólového LC-MS/MS dosáhnout velmi krátkých doby analýzy při zachování analytické kvality.

Cíle a přehled studie

Cílem byla demonstrace vysoce propustné analýzy šesti standardních metabolitů (resorufin, 4'-hydroxydiclofenac, oxidovaný nifedipin, 6-hydroxychlorzoxazone, 7-hydroxycoumarin, hydroxy tolbutamid) v metanolických vzorcích z incubací s lidskými jaterními mikrozomy. Studie hodnotí rychlost metody (0,80 min včetně ekvilibrace), opakovatelnost retenčních časů a ploch chromatografických píků, linearitu kalibrací a vliv matice (matrix effect) při použití systému Nexera X4 + LCMS-8060RX.

Použitá metodika

Vzorky byly připraveny z CYP‑mediovaných inkubací s lidskými jaterními mikrozomy: směs mikrozomů (0,2 mg/mL), substráty (coumarin, diclofenac 2 µmol/L; nifedipin 1 µmol/L) v 100 mM fosfátovém pufru pH 7,4. Pro zahájení metabolismu byla přidána systém regenerace NADPH (MgCl2, glukosa‑6‑fosfát, NADP+, glukosa‑6‑fosfát dehydrogenáza). Postup přípravy:

• předinkubace 5 min při 37 °C
• aktivace přidáním NADPH regenerace, inkubace 10 min při 37 °C
• ukončení reakcí přidáním 300 µL ledového acetonitrilu
• centrifugace 10 000 g, 10 min
• odebrání 150 µL supernatantu pro měření

Chromatografie probíhala na krátké C18 kolonce (Shim-pack Scepter C18-120, 20 × 2.1 mm, 1.9 µm) při 30 °C, průtok 0,4 mL/min, injekční objem 1 µL. Mobilní fáze: A = voda s 0,05 % kyseliny mravenčí, B = acetonitril s 0,05 % kyseliny mravenčí. Gradient: 3 % B (0–0,05 min) → 95 % B (0,20–0,60 min) → návrat na 3 % do 0,80 min; doba analýzy včetně ekvilibrace 0,80 min. Analýza je prováděna v režimu MRM s pozitivní i negativní ionizací ESI.

Použitá instrumentace

Hlavní instrumenty a klíčové parametry:

• UHPLC: Nexera X4 – zajišťuje konzistentní dodávku rozpouštědel při vysoce rychlých gradientních bězích, toolless fitování pro rychlou výměnu kolonek, mikro‑mixer, externí rinsing.
• Kolonka: Shim-pack Scepter C18-120 (20 × 2.1 mm, 1.9 µm).
• Vial: Shim‑vial H (150 µL) – malovolumová injekční nádobka s omezenou plochou kontaktu pro snížení adsorpce a zlepšenou tepelnou vodivostí (reziduální objem ~10 µL).
• MS: LCMS‑8060RX (triple kvadrupól) s CoreSpray ionizací – ESI v pozitivním i negativním režimu, režim měření MRM. CoreSpray zlepšuje uniformitu nebulizace a stabilitu ionizace při vyšších průtocích (až 7 L/min).
• MS parametry (ukázka): interface 400 °C, DL 300 °C, block heater 400 °C, nebulizing 5 L/min, heating 15 L/min, drying 5 L/min.

Hlavní výsledky a diskuse

Rychlost a opakovatelnost:

• Doba analýzy včetně ekvilibrace: 0,80 min na vzorek, umožňuje velmi vysoký throughput.
• Opakovatelnost retenčních časů (n=6): standardní odchylky 0,010–0,013 s (tj. velmi malá variabilita).
• Relativní standardní odchylka (RSD) ploch píků ≤ 3,0 % — dostatečná pro kvantitativní analýzu v rutinním provozu.

Linearity a citlivost:

• Kalibrační rozsahy jednotlivých metabolitů pokrývaly 0,01–200 nmol/L v závislosti na sloučenině; koeficient determinace R2 > 0,995 pro všechny analyty v uvažovaném rozsahu.
• Nejnižší kvantifikovatelné koncentrace (LLOQ) dosahovaly hodnoty řádově 0,01–0,5 nmol/L v závislosti na analyzu (např. oxidovaný nifedipin 0,01 nmol/L).

Vliv matice:

• Matrix factor (MF) testovaný přídavkem analytů do neoznačených CYP‑inkubátů se pohyboval mezi 0,89 a 1,07, což indikuje minimální matriční potlačení nebo zesílení signálu a celkově přijatelnou stabilitu kvantifikace v daném typu vzorku.

Analýza vzorků po CYP inkubacích:

• V nezaslepených vzorcích bez přídavku substrátu nebyly pozorovány interferenční píky v retenčních pozicích cílových metabolitů.
• Vzorky se substrátem vykazovaly dobře tvarované píky u cílových metabolitů, což potvrzuje vhodnost metody pro sledování in vitro metabolitů.

Přínosy a praktické využití metody

Klíčové přínosy:

• Výrazné zrychlení analýzy umožňuje vysokou propustnost – vhodné pro PK studie, screening metabolitů a velké dávky vzorků v DMPK laboratořích.
• Dostatečná přesnost, preciznost a linearita i při ultrarychlém režimu zajišťují použitelnost pro kvantitativní stanovení stopových metabolitů.
• Minimalizované matriční efekty a stabilní ionizace (CoreSpray) snižují potřebu rozsáhlých interních korekcí v jednoduchých inkubačních maticích.
• Nexera X4 poskytuje opakovatelné retenční časy i při velmi krátkých rozbězích, což usnadňuje automatizaci a škálování provozu.

Praktická doporučení:

• U komplikovanějších biologických matic (plazma, sérum) doporučit validační kroky zaměřené na vyhodnocení extrakce, interních standardů a případné úpravy přípravy vzorků.
• Při nasazení do regulovaného prostředí přidat plnohodnotnou validaci metody podle příslušných směrnic (LLOQ, selektivita, stabilita, recovery, apod.).

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a integrace této přístupné konfigurace:

• Další zrychlení a miniaturizace (microflow/nanoflow) pro snížení spotřeby vzorku a rozpouštědel.
• Integrace plně automatizovaných systémy přípravy vzorků a robotiky pro ultra‑high throughput analýzy v preklinickém vývoji.
• Kombinace MRM triple‑quad kvantifikace s HRMS (orbitrap/TOF) pro současnou kvantifikaci a identifikaci neočekávaných metabolitů.
• Využití pokročilých výpočetních postupů a strojového učení pro rychlé zpracování chromatografických dat, dekonvoluci signálu a predikci metabolických cest.
• Rozšíření metody do klinických farmakokinetických studií s odpovídající validací a kontrolami kvality.

Závěr

Popisovaná metoda spojující Nexera X4 UHPLC a LCMS‑8060RX triple kvadrupól poskytuje velmi rychlou (0,80 min), přesnou a reprodukovatelnou platformu pro kvantifikaci běžných CYP‑metabolitů. Metoda vykazuje vynikající opakovatelnost retenčních časů a ploch, výbornou linearitu a nízký vliv matice, což ji činí vhodnou pro vysokopropustné aplikace v DMPK a předklinickém screeningu. Pro nasazení do složitějších matic nebo regulačních studií je doporučena rozšířená validace a optimalizace přípravy vzorků.

Reference

• Miho Kawashima. High‑Throughput Analysis of Drug Metabolites Using a Triple Quadrupole LC‑MS/MS System. Shimadzu Application News, First Edition Aug. 2026. (Popis metodiky a výsledků pro Nexera X4 a LCMS‑8060RX)