An Improved Workflow for Profiling and Quantitation of Sialic Acids in Biotherapeutics

Význam tématu

Glykosylace bioterapeutických glykoproteinů, zejména zakončená terminálními sialovými kyselinami Neu5Ac a Neu5Gc, ovlivňuje imunogenicitu, farmakokinetiku a farmakodynamiku léčivých proteinů.

Neu5Ac je běžnou složkou lidských glykoproteinů, zatímco Neu5Gc může u člověka vyvolat imunitní reakci, a proto je klíčové přesně profilovat a kvantifikovat jejich zastoupení v bioterapeutikách.

Vysoce citlivá a reprodukovatelná analýza sialových kyselin je zásadní pro kontrolu kvality, vývoj i registraci nových biologických léčiv.

Cíle a přehled studie

Studie představuje zlepšený 96-destičkový pracovní postup pro uvolnění, značení a analýzu terminálních sialových kyselin v bioterapeutických glykoproteinech pomocí sady Agilent AdvanceBio Sialic Acid profiling and quantitation kit (p/n GS24-SAP).

Cílem bylo:

• Vyvinout rychlý a vysoce propustný protokol bez nutnosti sušení extracčních vzorků.
• Zajistit kvalitativní i absolutní kvantifikaci Neu5Ac a Neu5Gc pomocí DMB značení.
• Prokázat metodiku na modelech rituximab, etanercept, NISTmAb a cetuximab (Erbitux).

Použitá metodika a instrumentace

Pro uvolnění a značení sialových kyselin se vzorky (200 µg glykoproteinu u nízce sialylovaných a 5 µg u vysoce sialylovaných vzorků) zpracovaly v 96-destičkovém formátu:

• Acidní hydrolýza 2 h při 80 °C, odstranění sušení vzorku.
• DMB značení 3 h při 50 °C v termocykleru.
• Separace DMB-derivátů reverzní fází UHPLC (10 minutový gradient) s fluorescence detekcí (Ex 373 nm/Em 448 nm).
• Možné potvrzení struktury inline pomocí Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF MS.

Instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity II UHPLC (pumpa G7120A, autosampler G7167B, termostat G7116B).
• Agilent Poroshell 120 EC-C18 kolona (2.1 × 75 mm, 2.7 µm).
• Agilent 1260 Infinity II FLD (λEx 373 nm, λEm 448 nm).
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF (dual AJS ESI, m/z 400–1000 MS, 100–550 MS/MS).
• Softwary Agilent OpenLab CDS 2.3 a MassHunter Qualitative Analysis 10.0.

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow dovoluje rozlišit a detekovat sedm DMB-derivátů sialových kyselin (Neu5Ac, Neu5Gc, Neu5,7Ac2, Neu5Gc9Ac, Neu5,8Ac2, Neu5,9Ac2, Neu5,7(8),9Ac3) s konzistentním pořadím eluce.

Profilování standardních bioterapeutik:

• Rituxan a Enbrel: převládá Neu5Ac.
• NISTmAb a Erbitux: převládá Neu5Gc.

Kvantifikace pomocí kalibračních křivek ukázala LOD pro Neu5Ac 0,016 pmol a LOQ 0,053 pmol; pro Neu5Gc LOD 0,012 pmol a LOQ 0,040 pmol.

Naměřené hodnoty pmol/µg odpovídají výsledkům jiných DMB workflow i standardnímu AdvanceBio SAQ testu, přičemž nový protokol nabízí vyšší signál a kratší čas přípravy.

Přínosy a praktické využití metody

Výhodami navrženého postupu jsou:

• Zvýšená propustnost a zjednodušená příprava vzorků bez sušení.
• Vysoká citlivost pro detekci i kvantifikaci nízkých hladin sialylace.
• Možnost simultánního kvalitativního potvrzení MS a absolutní kvantifikace FLD.
• Vhodné pro QC laboratoře i vývoj nových bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Automatizace a miniaturizace přípravy vzorků pro další zvýšení throughput.
• Rozšíření workflow o pokročilé MS/MS analýzy a další modifikace glyků.
• Integrace do digitálních platforem pro online monitorování kvality.
• Vývoj nových derivačních činidel pro lepší separaci vzácných sialových izomerů.

Závěr

AdvanceBio Sialic Acid profiling and quantitation kit poskytuje robustní, rychlý a citlivý postup pro komplexní analýzu terminálních sialových kyselin v bioterapeutikách, s ověřenou reprodukovatelností a přesností odpovídající potřebám průmyslové QC i výzkumu.

Reference

1. Varki A. Sialic Acids in Human Health and Disease. Trends Mol Med. 2008, 14(8), 351–360.
2. Liu L. Antibody Glycosylation and its Impact on the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Monoclonal Antibodies and Fc-Fusion Proteins. J Pharm Sci. 2015, 104(6), 1866–1884.
3. Li Y. et al. Sialylation on O-glycans Protects Platelets from Clearance by Liver Kupffer Cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2017, 114(31), 8360–8365.
4. Scallon BJ. et al. Higher Levels of Sialylated Fc Glycans in Immunoglobulin G Molecules can Adversely Impact Functionality. Mol Immunol. 2007, 44(7), 1524–1534.
5. Kaneko Y. et al. Anti-inflammatory Activity of Immunoglobulin G Resulting from Fc Sialylation. Science. 2006, 313, 670–673.