Rapid High-Throughput Profiling and Quantitation of Sialic Acids in Biotherapeutics

Význam tématu

Glykové řetězce na bioterapeutických glykoproteinech významně ovlivňují jejich imunogenicitu, farmakokinetiku i farmakodynamiku. Terminální sialové kyseliny mají klíčovou roli v modulaci clearance, účinnosti protilátek a protizánětlivých vlastností. Zvláště je třeba sledovat jak celkové množství sialových kyselin, tak podíl imunitně reaktivního Neu5Gc, který není u člověka přirozeně syntetizován.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl představit vysoce efektivní workflow pro rychlé uvolnění, značení a kvantitativní analýzu sialových kyselin z bioterapeutik ve formátu 96jádrové destičky. Jako modelové proteiny byly zvoleny protilátky Rituxan, Enbrel, Cetuximab a standard NISTmAb. Výsledkem je desetiminutová RP UHPLC metoda s fluorescenční i hmotnostní detekcí.

Použitá metodika a instrumentace

• Uvolnění sialových kyselin z glykoproteinů probíhá řízenou kyselinovou hydrolýzou bez nutnosti fáze sušení vzorku.
• Značení 1 2 diamino 4 5 methylenedioxybenzenu (DMB) ve dvoukrokovém postupu v termocykleru.
• Separace pomocí reverzní fáze UHPLC na Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC C18 kolonce za izokratických podmínek (10 minut, 0,4 ml/min).
• Detekce fluorescencí (Ex 373 nm, Em 448 nm) a volitelně online Q-TOF MS pro potvrzení hmotnostních iontů.
• Kvantifikace založena na kalibračních křivkách pro Neu5Ac a Neu5Gc s citlivostí na úrovni pikomolů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Metoda rozlišila šest DMB derivátů sialových kyselin včetně Neu5Ac, Neu5Gc a jejich acetylovaných forem během 10 minut.
• LOD a LOQ pro Neu5Gc činily 0,012 a 0,040 pmol, pro Neu5Ac 0,016 a 0,053 pmol.
• Rituxan a Enbrel obsahovaly převážně Neu5Ac, zatímco NISTmAb a Cetuximab vykazovaly vyšší obsah Neu5Gc.
• Reprodukovatelnost byla vysoká (CV pod 10 procent), workflow odstraňuje časově náročné sušení vzorků.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow umožňuje vysokopropustnou a citlivou analýzu sialace bioterapeutik ve formátu 96 vzorků, vhodnou pro rutinní QA/QC i výzkumné laboratoře. Metoda zkracuje dobu přípravy, zajišťuje spolehlivé rozlišení a kvantifikaci Neu5Ac a Neu5Gc až na pikomolové úrovni.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metody na další typy glykokonjugátů včetně O glykosidů, integrace do plně automatizovaných platforem a kombinace s pokročilými glykoanalytickými technikami. Dále je možné adaptovat protokol pro průmyslovou validaci a sledování kvality bioterapeutik v reálném čase.

Závěr

Představený workflow zvyšuje propustnost a citlivost analýzy sialových kyselin v bioterapeutikách, eliminuje časově náročné kroky a poskytuje spolehlivé výsledky pro monitorování klíčových glykanových modifikací v průmyslovém i akademickém prostředí.

Reference

1. Liu L Antibody Glycosylation and its Impact on the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Monoclonal Antibodies and Fc Fusion Proteins J Pharm Sci 2015 104 6 1866 1884
2. Varki A Sialic acids in human health and disease Trends Mol Med 2008 14 8 351 360
3. Li Y et al Sialylation on O glyans protects platelets from clearance by liver Kupffer cells Proc Natl Acad Sci USA 2017 114 31 8360 8365
4. Scallon BJ et al Higher levels of sialylated Fc glycans in immunoglobulin G molecules can adversely impact functionality Mol Immunol 2007 44 7 1524 1534
5. Kaneko Y et al Anti inflammatory Activity of Immunoglobulin G Resulting from Fc Sialylation Science 2006 313 670 673