Rapid High-Throughput Profiling and Quantitation of Sialic Acids in Biotherapeutics

Význam tématu

Monitoring sialových kyselin na terapeutických glykoproteinech je klíčový pro zajištění jejich bezpečnosti a účinnosti. Sialová zakončení ovlivňují farmakokinetiku, farmakodynamiku a imunitní odpověď, přičemž Neu5Ac je u lidí běžná forma a Neu5Gc může vyvolat nežádoucí imunitní reakce.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo vyvinout vysokopropustný (high-throughput) workflow pro uvolnění, derivatizaci a kvantifikaci sialových kyselin z bioterapeutik v 96-destičkovém formátu. Studie demonstruje aplikaci na vzorcích Rituxanu, Enbrelu, NISTmAb a Cetuximabu.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow zahrnuje:

• Acidní hydrolýzu (2 h, 80 °C) pro uvolnění sialových kyselin z glykoproteinů.
• Derivatizaci 1,2-diamino-4,5-metylenodioxybenezenu (DMB) (3 h, 50 °C) bez nutnosti sušení vzorku.
• RP-UHPLC separaci na Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 kolóně (2,1×75 mm, 2,7 µm).
• Detekci fluorescencí (Ex 373 nm, Em 448 nm) a hmotnostní analýzu (ESI-Q-TOF, m/z 400–1000).

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II UHPLC (FLD)
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF (ESI-Q-TOF, 4 GHz HR)
• Agilent 1260 Infinity II FLD

Hlavní výsledky a diskuse

RP-UHPLC-FLD/MS metoda umožnila separaci a detekci šesti derivátů sialových kyselin (Neu5Ac, Neu5Gc, Neu5,7Ac2, Neu5Gc,9Ac, Neu5,8Ac2, Neu5,9Ac2, Neu5,7(8),9Ac3) během 10 minut. LOD pro Neu5Gc dosáhla 0,012 pmol, LOQ 0,040 pmol; pro Neu5Ac LOD 0,016 pmol, LOQ 0,053 pmol. Kalibrační křivky pro Neu5Ac a Neu5Gc měly R²>0,999. V analytických vzorcích převládal Neu5Ac u Rituxanu a Enbrelu, zatímco u NISTmAb a Cetuximabu převažoval imunitogenní Neu5Gc.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Vysokou propustnost díky 96-destičkovému formátu a eliminaci sušení vzorku.
• Rychlou analýzu (<10 minut) a citlivost na úrovni pikomolů.
• Možnost kombinované FLD a MS detekce pro kvalitativní i kvantitativní vyhodnocení.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje zahrnují:

• Plnou automatizaci přípravy vzorků a integraci s robotickými systémy.
• Rozšíření na celkovou glykanovou charakterizaci (N- a O-glykany).
• Aplikaci strojového učení pro predikci glycovariací a vazebná modelování.
• Nasazení v klinických studiích a kontrola kvality při výrobě bioterapeutik.

Závěr

Nový vysokopropustný workflow pro uvolnění, derivatizaci a analýzu sialových kyselin poskytuje spolehlivou a rychlou alternativu ke stávajícím postupům. Metoda zkracuje přípravu, zvyšuje citlivost a podporuje jak kvalitativní, tak kvantitativní hodnocení struktury glykosidů bioterapeutik.

Reference

1. Liu L. Antibody Glycosylation and its Impact on the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Monoclonal Antibodies and Fc-Fusion Proteins. J. Pharm. Sci. 2015, 104(6), 1866–1884.
2. Varki A. Sialic acids in human health and disease. Trends Mol Med. 2008, 14(8), 351–360.
3. Li Y. et al. Sialylation on O-glycans protects platelets from clearance by liver Kupffer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2017, 114(31), 8360–8365.
4. Scallon B. J. et al. Higher levels of sialylated Fc glycans in immunoglobulin G molecules can adversely impact functionality. Mol Immunol. 2007, 44(7), 1524–1534.
5. Kaneko Y. et al. Anti-inflammatory Activity of Immunoglobulin G Resulting from Fc Sialylation. Science. 2006, 313, 670–673.