Fully Automated Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants Using 4D-LC/MS

Význam tématu

Monoklonální protilátky patří k nejrychleji rostoucí třídě biofarmak s vysokou strukturální složitostí. Jejich účinnost, bezpečnost a stabilita silně závisí na heterogenitě posttranslačních modifikací, ze kterých jsou nejvýznamnější nabíjecí varianty vznikající deamidacemi, izomerizacemi a odštěpením C-terminálního lysinu. Efektivní a automatizovaná analýza těchto variant je klíčová pro kontrolu kvality a rychlý vývoj terapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo navrhnout a demonstrovat plně automatizovanou čtyřrozměrnou LC/MS metodu (4D-LC/MS) pro detailní charakterizaci nabíjecích variant monoklonálních protilátek. Studie ukazuje integraci čtyř pečlivě řízených kroků – cation-exchange chromatografie (CEX), online desalting/denaturace/redukce, tryptická digesce a RPLC-MS peptide mapping – do jednoho protokolu bez manuálních zásahů.

Použitá instrumentace

• Agilent InfinityLab 1290 Infinity II 2D-LC Solution s vysokorychlostním pumpami, multislámplrem a vícepozicovými ventily
• Agilent 1260 Infinity II quaternary a isokratický pump systém
• Agilent 6545 LC/Q-TOF s Jet Stream ESI zdrojem
• Polymerická RP patrona pro odbourání solí a mřížka kolony pro tryptickou digesci
• AdvanceBio peptide mapping kolona pro separaci fragmentů

Použitá metodika

1. Dimenze (CEX): separace nabíjecích variant na Bio MAb kolóně pomocí fosfátového pufru s NaCl gradientem.
2. Dimenze (RP desalting/denaturace/redukce): zachycení frakcí CEX na RP cartridgi, denaturace a redukce DTT za gradientního proplachu.
3. Dimenze (tryptická digesce): online převedení eluátu na pekti buffer s trypsinem, provoz na separační kolóně StyrosZyme.
4. Dimenze (RPLC-MS peptide mapping): rozdělení peptidů na AdvanceBio kolóně a detekce DAD a Q-TOF pro identifikaci a kvantifikaci modifikovaných a nemodifikovaných sekvencí.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla sekvenčního pokrytí přes 90 % sekvence trastuzumabu. Čtyři hlavní CEX frakce odpovídaly nemodifikované formě, jedné a dvakrát deamidované formě (Asn30 v lehkém řetězci) a izomerizované variantě (Asp102 v těžkém řetězci). Vysoké pH stresování vedlo k posunu CEX profilu a umožnilo odhalit až dvě deamidace na obou řetězcích zcela online. Výsledky potvrdily konzistenci s literaturou a demonstrovaly schopnost rychlého „on-the-fly“ mapování míst modifikací.

Přínosy a praktické využití metody

• Plná automatizace eliminuje manuální odběr a přepojování frakcí, snižuje riziko kontaminace
• Integrovaný protokol zkracuje dobu analýzy a zvyšuje reprodukovatelnost
• Detailní lokalizace modifikací přímo na peptidové úrovni usnadňuje bezpečnostní a stabilitní hodnocení produktů
• Platforma je flexibilní – lze vyměnit CEX za Protein A, SEC nebo HIC podle analytické potřeby

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření 4D-LC/MS platforem pro komplexní analýzu glykoform, disulfidových vazeb a antikorová terapeutika konjugovaná s malými molekulami (ADC). Vývoj rychlejších enzymatických kolen a pohotovějších 2D-LC software modulů povedou k ještě vyššímu průchodnímu toku a integraci s umělou inteligencí pro automatizovanou interpretaci dat.

Závěr

Přednesená 4D-LC/MS metoda představuje robustní, plně automatizované řešení pro detailní charakterizaci nabíjecích variant monoklonálních protilátek. Umožňuje rychlé, reprodukovatelné a vysoce citlivé mapování modifikací bez manuálních zásahů, což významně podporuje vývoj a kontrolu kvality biofarmak.

Reference

1. Sandra, K. et al. Modern Chromatographic and Mass Spectrometric Techniques for Protein Biopharmaceutical Characterization. J. Chromatogr. A 2014, 1335, 81–103.
2. Fekete, S. et al. Chromatographic, Electrophoretic and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals. Anal. Chem. 2016, 88, 480–507.
3. Walsh, G. Biopharmaceutical Benchmarks 2018. Nat. Biotechnol. 2018, 32, 992–1000.
4. Harris, R. J. et al. Identification of Multiple Sources of Charge Heterogeneity in a Recombinant Antibody. J. Chromatogr. B 2001, 752, 233–245.
5. Stoll, D. et al. Characterization of Therapeutic Antibodies and Related Products by Two-Dimensional Liquid Chromatography Coupled with UV Absorbance and Mass Spectrometric Detection. J. Chromatogr. B 2016, 1032, 51–60.
6. Sandra, K. et al. Characterizing Monoclonal Antibodies and Antibody-Drug Conjugates using 2D-LC-MS. LCGC Europe 2017, 30, 149–157.
7. Stoll, D. R. et al. Direct Identification of Rituximab Main Isoforms and Subunit Analysis by Online Selective Comprehensive Two-Dimensional Liquid Chromatography–Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2015, 87, 8307–8315.
8. Sandra, K. et al. Multiple Heart-Cutting and Comprehensive Two-Dimensional Liquid Chromatography Hyphenated to Mass Spectrometry for the Characterization of the Antibody-Drug Conjugate Ado-Trastuzumab Emtansine. J. Chromatogr. B 2016, 1032, 119–130.
9. Schneider, S. 2D-LC/MS Characterization of Charge Variants Using Ion Exchange and Reversed-Phase Chromatography. Agilent Technologies application note, 2016.
10. Gstöttner, C. et al. Fast and Automated Characterization of Antibody Variants with 4D HPLC/MS. Anal. Chem. 2018, 90, 2119–2125.
11. Goyon, A. et al. Streamlined Characterization of an Antibody-Drug Conjugate by Two-Dimensional and Four-Dimensional Liquid Chromatography/Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2019, 91, 14896–14903.
12. Goyon, A. et al. From Proof of Concept to the Routine Use of an Automated and Robust Multi-Dimensional Liquid Chromatography Mass Spectrometry Workflow Applied for the Charge Variant Characterization of Therapeutic Antibodies. J. Chromatogr. A 2020, doi:10.1016/j.chroma.2019.460740.
13. Vandenheede, I. et al. Characterize mAb Charge Variants by Cation-Exchange Chromatography. Agilent Technologies application note, 2014.