High-Performance Biopharma Analysis - Application compendium

Význam tématu

V rostoucím počtu analytických laboratoří, které zpracovávají jak malé molekuly, tak biopolymery (proteiny, oligonukleotidy), roste poptávka po univerzálních a přitom vysoce výkonných kapalinových chromatografech. Zajištění opakovatelné přesnosti míchání elučních a isokratických fází je klíčové pro robustní separace v režimu reverzní fáze i pro biokompatibilní aplikace s vysokými koncentracemi solí či organických modifikátorů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat výkon čtyřkanálového čtyřpístového čerpadla Agilent 1260 Infinity II Prime Bio LC (biokompatibilní, bez nerezové oceli v cestě vzorku) s jeho standardní verzí 1260 Infinity II Prime LC. Testovány byly tři typy aplikací:

• Izokratická analýza referenčního vzorku.
• Rychlý gradientní běh (RRLC mix, gradient 20→90 % B za 5 min).
• Mělký gradient (komplexní Ganoderma Lucidum extrakt, gradient 20→38,5 % B za 52 min).

Použitá metodika a instrumentace

Přístroje
– Agilent 1260 Infinity II Prime Bio LC System: čtyřkanálové čerpadlo, biokompatibilní multisampler, multicolumn termostat s teplotními zónami, VWD detektor s bio-mikroflow cell
– Agilent 1260 Infinity II Prime LC System: obdobná konfigurace se standardními nerezovými cestami
– Agilent OpenLab CDS 2.5 pro řízení a zpracování dat

Metody

• Izokratická: 65 % organiky (A/B nebo C/D), běh 20 min pro test přesnosti a kompatibility fází.
• Fast gradient: 0→90 % B za 5 min (celkem 6 min); rychlý gradient na 2,1×50 mm Poroshell C18.
• Shallow gradient: 20→26,5 % B za 3 min, 26,5 % isokrat. za 31 min, 26,5→38,5 % B za 18 min (celkem 55 min) pro komplexní triterpenoidní extrakt.

Hlavní výsledky a diskuse

• Izokratická analýza: Všechny čtyři vzorky vykázaly RSD ret. času ≤ 0,05 % a RT rozdíly mezi systémy ≤ 0,3 s (≤ 0,6 %).
• Fast gradient: RT RSD ≤ 0,14 % pro jednotlivé hroty, rozdíly mezi systémy < 1,7 %.
• Shallow gradient: Při mělkém gradientu došlo k RT posunům > 5 %. Modelové přepočítání isokratického držení ukázalo, že drobné chyby míchání (± 0,2 % B) mohou vést k > 1 min posunu retence. Ukazuje to nutnost citlivého vyhodnocení kompatibility pro velmi mělké gradienty.

Přínosy a praktické využití metody

• Agilent 1260 Infinity II Prime Bio LC umožňuje se stejnou hloubkou výkonu provozovat jak standardní RP-LC aplikace, tak bioanalytické metody s vysokým obsahem solí a organických čisticích fází.
• Metoda kompatibility potvrzuje, že mezi Bio a standardním Prime čerpadlem lze snadno přenášet izokratické a rychlé gradientní metody.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další integrace multiaplikací (proteiny, oligo, malé molekuly) na jediné platformě pro úsporu prostoru a zjednodušení validace.
• Prohlubování využití biokompatibilních LC systémů pro online/bio-inertní aplikace spojené s bioprocesy (PAT).

Závěr

Nové biokompatibilní čtyřkanálové řešení Agilent 1260 Infinity II Prime Bio LC nabízí srovnatelnou míchanou přesnost fází a výkonnost jako standardní Agilent 1260 Infinity II Prime LC. Metody izokratické a rychlého gradientu jsou mezi systémy plně kompatibilní, pro mělké gradienty je třeba zohlednit citlivost na složení eluční fáze. Celkově je Bio LC ideální volbou pro kombinaci RP a bioaplikací na jediné validovatelné platformě.

Reference

1. USP Monograph Ganoderma lucidum Fruiting Body, 2015.
2. USP Certificate Ganoderma lucidum Extract F012B0, 2014.