Determination of Multiple Attributes of Monoclonal Antibodies

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují vysoce komplexní biologické produkty, jejichž kvalitativní a kvantitativní charakterizace je klíčová pro zajištění bezpečnosti a účinnosti farmaceutických přípravků. Díky variabilitě posttranslačních modifikací, agregaci a heterogenitě glykosylace vyžaduje vývoj i kontrola mAb analýzu na více úrovních současně. 3D-LC/MS platforma integrující Protein A, více chromatografických režimů (SEC, CEX, HIC) a desalting SEC-MS umožňuje rychlou a komplexní multi-attribute analýzu přímo ze supernatantů buněčné kultury.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat plně automatizované simultánní stanovení titru, velikostních (HMW/LMW), nábojových a hydrofobních variant, molekulové hmotnosti, aminokyselinové sekvence a posttranslačních modifikací monoklonální protilátky (trastuzumab) i jejích CHO-buněčných klonů. Ke splnění tohoto cíle byla použita inovativní trojrozměrná LC/MS konfigurace s volbou druhé dimenze („multimethod“ SEC/CEX/HIC) a SEC-desaltingem pro MS.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika spočívá v následujících krocích:

• 1D: Protein A afinitní chromatografie – vyčištění mAb a stanovení titru pomocí UV 280 nm.
• 2D: Výběr chromatografické režimu (SEC, CEX, HIC) prostřednictvím čtyřpolohového voliče kolony; multimethod sekvenční heart-cut do smyček.
• 3D: Desalting SEC pro odsolení frakcí a přímá analýza na Agilent 6530 LC/Q-TOF (ESI).

Instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity II 2D-LC System s quaternary pumpou, multisamplerem, vícepolohovým voličem kolony a ASM ventilem.
• Agilent 1260 Infinity II Quaternary Pump s aktivním vstupním ventilem.
• Agilent 1290 Infinity II Diode Array Detector (Max-Light cartridge).
• Agilent 6530 LC/Q-TOF s Jet Stream ESI zdrojem pro vysokorozlišenou MS detekci.

Hlavní výsledky a diskuse

Pomocí Protein A UV kalibrační křivky (0,02–2,0 µg/µL) bylo stanovení titru trastuzumabu v CHO supernatantech robustní (R² = 0,9998). 2D SEC separace prokázala rozdíly v obsahu HMW/LMW variant mezi originátorem a klony. 2D CEX odhalila nábojové modifikace (deamidace, isomerizace, C-terminální lyzinové addukty) a jejich podíl v různých klonech. 2D HIC vyzdvihla hydrofobní varianty a odlišnou aduktaci sulfonátem. Deconvoluovaná 3D SEC-MS umožnila potvrdit molekulovou hmotnost monomeru i dimerní frakcí, včetně rozlišení kovalentních a nekovalentních agregátů. Automatické přepínání mezi 2D režimy nevedlo k degradaci chromatografické kvality.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní inline analýza bez offline čištění a frakcionace.
• Rychlé hodnocení klonů z hlediska titru i heterogenity variant (QA/QC, vývoj biosimilars).
• Úspora času a redukce nákladů spojených s manuální přípravou vzorků.
• Flexibilita volby chromatografického režimu podle analytického záměru.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření platformy o další dimenze (top-down proteomika, online digesce), využití vysokorozlišené MS/MS pro detailní mapování PTM a nástup umělé inteligence při vyhodnocování komplexních dat. Integrace automatizované vzorkové přípravy a adaptivního chromatografického návrhu by mohla dále zvýšit throughput a reproducibilitu.

Závěr

Popsaná 3D-LC/MS multi-attribute platforma nabízí ucelený a plně automatizovaný přístup ke komplexní charakterizaci monoklonálních protilátek. Díky možnosti volby SEC/CEX/HIC v druhé dimenzi a přímé MS analýze po desaltingu je metoda vhodná jak pro vývoj bioterapeutik, tak pro rutinní QA/QC laboratoře.

Reference

1. Sandra, K.; Vandenheede, I.; Sandra, P. Modern Chromatographic and Mass Spectrometric Techniques for Protein Biopharmaceutical Characterization. J. Chromatogr. A 2014, 1335, 81–103.
2. Fekete, S. et al. Chromatographic, Electrophoretic and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals. Anal. Chem. 2016, 88, 480–507.
3. Walsh, G. Biopharmaceutical Benchmarks 2018. Nat. Biotechnol. 2018, 32, 992–1000.
4. Stoll, D. R. et al. Characterization of Therapeutic Antibodies and Related Products by Two-Dimensional Liquid Chromatography Coupled with UV Absorbance and Mass Spectrometric Detection. J. Chromatogr. B 2016, 1032, 51–60.
5. Sandra, K. et al. Characterizing Monoclonal Antibodies and Antibody-Drug Conjugates using 2D-LC-MS. LCGC Europe 2017, 30, 149–157.
6. Stoll, D. R. et al. Direct Identification of Rituximab Main Isoforms and Subunit Analysis by Online Selective Comprehensive Two-Dimensional Liquid Chromatography–Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2015, 87, 8307–8315.
7. Sandra, K. et al. The Versatility of Heart-Cutting and Comprehensive Two-Dimensional Liquid Chromatography in Monoclonal Antibody Clone Selection. J. Chromatogr. A 2017, 1523, 283–292.
8. Vanhoenacker, G. et al. Multi-Attribute Analysis of Monoclonal Antibodies Using the Agilent InfinityLab 2D-LC Solution and Q-TOF MS. Agilent Technologies application note 5994-0947EN, 2020.
9. Harris, R. J. et al. Identification of Multiple Sources of Charge Heterogeneity in a Recombinant Antibody. J. Chromatogr. B 2001, 752, 233–245.
10. Verscheure, L. et al. Fully Automated Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants Using 4D-LC/MS. Agilent Technologies application note 5994-2020EN, 2020.