Fully automated LC-MS/MS method to assess DPD deficiency in Cancer treatment with 5-FU

Význam tématu

Kontrola efektivity enzymu dihydropyrimidin dehydrogenázy (DPD) je klíčová pro bezpečné podávání fluoropyrimidinů (5-fluorouracil, capecitabine). DPD deficit vede k životu ohrožující toxicitě. Biochemické stanovení poměru uracilu/dihydrouracilu (uracilemie) v plazmě představuje přímé fenotypizační řešení překonávající omezení genotypických metod a zajišťuje komplexní identifikaci všech forem nedostatku enzymu.

Cíle a přehled studie / článku

Vyvinout a plně automatizovat vysoce průchodný LC-MS/MS protokol měření koncentrací uracilu a dihydrouracilu v plazmě. Metoda byla validována podle ISO 15189 pro parametry opakovatelnosti, reprodukovatelnosti, recovery, matriční efekt a selektivitu. Jako kritická prahová hodnoty uracilemie byly navrženy 16 ng/ml pro částečnou a 150 ng/ml pro úplnou DPD deficienci.

Použitá metodika a instrumentace

• Automatizovaná příprava vzorku na robotickém přístroji CLAM-2030 (Shimadzu) přímo napojeném na LC-MS/MS systém.
• Postup přípravy vzorku:
  
  1. Přidat 20 μl isopropanolu
  2. Přidat 20 μl plazmy
  3. Přidat 10 μl interního standardu (13C15N deriváty)
  4. Přidat 40 μl acetonitrilu s 1 % kyselinou mravenčí
  5. Vibroinkubace 2 min při 1 900 rpm
  6. Filtrace 2 min
  7. Ředění extraktu vodou (1:9) a přímá injekce
• LC podmínky:
  Analytická kolona Hypercarb 2,1 × 150 mm, 3 μm; mobilní fáze A: voda + 0,5 % kyselina octová; B: acetonitril + 0,5 % kyselina octová; průtok 0,25 ml/min; teplota 25 °C; objem injekce 50 μl; gradientní program do 15 min.
• MS/MS podmínky:
  Ionizace ESI kladná; interface 1 kV; DL 300 °C; heat block 500 °C; gas flows—nebulizér 3 l/min, drying 3 l/min, heating 14 l/min; MRM přechody pro uracil, dihydrouracil a izotopické interní standardy.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala lineární kalibraci v rozmezí 5–320 ng/ml (uracil) a 10–640 ng/ml (dihydrouracil) s hodnotami R² >0,99. Intra- i interassay testy (n=6) vykázaly přesnosti 85–104 % a RSD do 8,8 %. Limit kvantifikace (LOQ) umožňuje spolehlivou detekci blízko prahových hodnot. Porovnání s referenční metodou u 64 klinických vzorků ukázalo vynikající shodu (Bland-Altman ±2 SD).

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zrychlení zpracování (současná příprava a analýza) s časem 8 min na vzorek.
• Minimalizace chyb lidského faktoru a úspora laboratorního personálu.
• Nástroj pro personalizaci dávkování fluoropyrimidinů a prevenci těžké toxicity.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace do diagnostických platforem pro kontinuální monitoring pacientů v režimu point-of-care.
• Rozšíření panelu biomarkerů pro další farmakogenetické a metabolomické klinické aplikace.
• Automatizace a demokracie dat: využití strojového učení pro predikci rizik na základě metabolických profilů.
• Miniaturizace a multiplexní analýzy pro snížení spotřeby vzorku i reagencií.

Závěr

Navržená plně automatizovaná LC-MS/MS metoda pro stanovení uracilu a dihydrouracilu umožňuje rychlou, robustní a vysoce přesnou fenotypizaci DPD deficience. Splňuje požadavky klinické rutiny a přispívá k individualizaci onkologické terapie.