Determination of Paralytic Shellfish Toxins and Tetrodotoxin in Shellfish using HILIC/MS/MS

Význam tématu

Paralytické toxiny měkkýšů (PST) patří mezi nejnebezpečnější přírodní neurotoxiny, které se akumulují v korýších a mlžích. Tetrodotoxin (TTX) představuje další rizikovou sloučeninu objevující se v bivalvech. Spolehlivé a citlivé metody pro jejich současné stanovení jsou klíčové pro ochranu spotřebitelů a splnění regulačních limitů.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované aplikace bylo vyvinout jednoduchou, rychlou a jednotnou metodu pro simultánní analýzu 25 konjugátů PST a TTX v měkkýších s využitím hydrofobní interakční chromatografie (HILIC) spojené s tandemovou hmotnostní spektrometrií (MS/MS). Metoda má nahradit složitý EU referenční LC/FLD postup a umožnit rutinní, vysoce průchodovou analýzu.

Použitá metodika a instrumentace

Většina toxinů byla extrahována z homogenizované tkáně shellfish 1% kyselinou octovou, za horka, následně odsrážena, zásaditě upravena a pročištěna na grafitovém uhlí (ENVI-Carb SPE). Stanovení probíhalo na Agilent 1290 Infinity II LC s amido HILIC kolonkou (2.1×150 mm, 1.7 µm) a Agilent 6495B triple kvadrupólu s iFunnel a JetStream ES ionizací. Metoda zahrnuje pre-kondicionaci kolony, start-up, analytický běh a odstavení.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II LC (G7120A, G7167B, G7116B)
• Agilent 6495B Triple Quadrupole LC/MS
• JetStream ESI (+/-) technologie
• Amide HILIC kolona 2.1×150 mm, 1.7 µm (amidosilika)
• Supelclean ENVI-Carb 250 mg SPE kolony
• Automatický SPE návrh Gilson Aspec XL-4 (volitelně)
• Boiling water bath, centrifuga, vortex, pipety

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla limitů detekce (LOD) 0,02–0,37 nmol/L a limitů kvantifikace (LOQ) 0,08–1,22 nmol/L. Kalibrace ve škále 0,22–515 nmol/L byla lineární (R²>0,994). Rozlišení epimerů (C1/C2, C3/C4, GTX1/GTX4, GTX2/GTX3, dcGTX1/dcGTX4, dcGTX2/dcGTX3) bylo kompletní, bez vzájemných interferencí. Vnitrobatchová opakovatelnost (RSD) 4–17 % (průměr 9 %) a mezi-batchová 8–23 % (průměr 13 %) prokázaly dobrou přesnost. Dlouhodobá reprodukovatelnost (1 rok) vykázala RSD 16–27 % (průměr 21 %). Analýza certifikovaného materiálu oyster tissue prokázala trueness 86–116 %.

Přínosy a praktické využití metody

Jednorázová extrakce a čištění šetří čas a spotřební materiál, HILIC/MS/MS poskytuje vyšší citlivost a selektivitu než LC/FLD. Metoda umožňuje rutinní monitoring toxinů v rámci regulačních limitů (800 µg STX eq/kg) a může být snadno adaptována pro vysokoprůchodová laboratorní pracoviště.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může zahrnovat rozšíření spektra detekovaných kontaminantů (další algotoxiny), nasazení vysoce výkonných hmotnostních analyzátorů (QTOF, HRMS), automatizované čistící moduly a miniaturizaci vzorkovacího procesu pro on-site testování.

Závěr

HILIC/MS/MS na platformě Agilent nabízí rychlý, citlivý a spolehlivý postup pro simultánní stanovení PST a TTX v měkkýších, splňující požadavky na přesnost, reprodukovatelnost i rutinní využití v akvakulturním a regulačním sektoru.

Reference

• 1. Hallegraef G.M., Manual on Harmful Marine Microalgae, UNESCO, 2003.
• 2. Llewellyn L. et al., Paralytic shellfish toxins in tropical oceans, Toxin Reviews 2006.
• 3. Commission Regulation (EC) No 853/2004 & 854/2004.
• 4. AOAC Official Method 959.08, 2005.
• 5. Turner A.D. et al., Multitoxin UHPLC-HILIC-MS/MS, J. AOAC Int. 2015.
• 6. Turner A.D. et al., LC-MS/MS pro Tetrodotoxin, J. AOAC Int. 2017.
• 7. Boundy M. et al., Graphitic Carbon SPE & HILIC UPLC-MS/MS, J. Chromatogr. A 2015.
• 8. Harwood D.T. et al., Paralytic shellfish toxins v abalone, Toxicon 2014.
• 9. EURL SOP Lipofilní toxiny v měkkýších, 2015.