Quantification of Host Cell Protein Impurities using the Agilent 6495C Triple Quadrupole LC/MS

Význam tématu

Hostitelské proteiny jako nečistoty (HCP) vznikají prípřavě biotečnických léčivých proteinů a mohou ovlivnit bezpečnost a účinnost produktů. Regulační autority vyžadují měření několika ppm až ppb HCP, aby byla zajištěna kvalita. Tradiční ELISA metody poskytují omezenou specificitu a pokrytí, zatímco LC MS prináší möžnost identifikace a kvantifikace jednotlivých HCP až do sub-ppm oblasti.

Cíle a přehled studie

Cílem příspěvku bylo vyvinout a ověřit plně automatizovaný workflow pro kvantifikaci HCP v produktúch monoklonálních protilateǩ (mAb) s citlivostí v režimu sub-ppm. Kombinace automatizace či připravy vzorků, vysoce vytávne chromatografie a ciěleného MRM na trojitém kvadrupolu mS prinesla rychlý a reprodukovatelný postup.

Použitá instrumentace

• Agilent AssayMAP Bravo system (G5571AA) pro automatizovanou přípravu vzorků
• Agilent 1290 Infinity II UHPLC: vysokorychlostní pumpa (G7120A), multisampler (G7167B), termostatovaná koloná
• Agilent 6495C Triple Quadrupole LC MS s JetStream ESI (G1958-65138)
• Agilent MassHunter Workstation, Skyline a Agilent Automation tool pro optimalizaci dMRM metody

Použitá metodika

Monoklonální protilátka byla denaturována, redukována, alkylována a trypticky trávena na platformě AssayMAP Bravo. Do digeštu byly přidány peptidy s terapíckými isotopěmí (SIL) ve dvanácti koncentračních úrovních od 6,25 amol/µg až 125 fmol/µg. Chromatografie proběhla na reverzně-činní C18 koloně s devetiminutovou gradientní metodou. Detekce a kvantifikace byly provedeny v dMRM režimu na trojitém kvadrupolu s automatickou optimalizací kolizního napětí.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vynikající linearitu (R2 > 0,999) pro tři kontrolní HCP peptidy (SUMO1_HUMAN, SYHC_HUMAN, CHO S100-A11). Limity kvantifikace (LLOQ) se pohybovaly v sub-ppm oblasti (0,13 až 0,70 ppm). Precision (RSD) prímého meření byla lěv̌ úrovni LLOQ pod 20 %, včetně retenční reproducibility <0,5 % RSD. Absolutní kvantifikace endogenního proteinu S100-A11 potvrdila koncentraci približně 1 ppm.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený postup nabízí vysokou specifičnost a citlivost pro monitorování HCP ve výrobních kontrolách biopharma produktů. Plná automatizace přípravy vzorků zvyšuje předůvoditelnost a propustnost, zkracuje dobu analýzy a minimalizuje lidské chyby. Metoda lze implementovat do QA/QC laboratoří s požadavkem na regulační shodu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšiřování panelu HCP peptidů, nasazení microflow LC pro zvýšení citlivosti a kapacity naložení kolony. Integrace vysoce rezolučních qTOF systémů nebo SWATH aproaches umožní šiří nestrukturální screening. Vyvíjí se i automatizované platformy pro online digest a připravu vzorků pro výrazně vysší propustnost.

Závěr

Prezentovaná kombinace Agilent AssayMAP Bravo, 1290 Infinity II a 6495C Triple Quadrupole LC MS spolu s inteligentním softwarem skyline a MassHunter poskytuje robustní, vysoce reprodukovatelné a citlivé řešení pro kvantifikaci HCP na sub-ppm úrovni. Workflow uspokojú narůstající požadavky biopharma praxé na specifičnost, přesnost a regulační shodu.

Reference

1. ICH Q6B Specifications Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological Biological Products
2. Host Cell Protein Analysis Using Agilent AssayMAP Bravo and 6545XT AdvanceBio LC Q TOF Application Note 5991-9300EN 2018
3. Agilent Triple Quadrupole LC MS Peptide Quantitation with Skyline Application Note 5990-9887EN 2017