Host Cell Protein Analysis Using Agilent AssayMAP Bravo and 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF

Význam tématu

Biologická léčiva, zejména monoklonální protilátky, se vyrábějí v kultivovaných buňkách, což může vést k přítomnosti stopových hostitelských proteinů (HCP) v konečném produktu. Díky jejich možnému vlivu na bezpečnost a účinnost léčiv musí být HCP přesně monitorovány a kontrolovány v souladu s regulačními požadavky. Tradiční ELISA poskytuje celkovou kvantifikaci HCP, neumožňuje však identifikaci jednotlivých proteinů a postrádá dostatečnou analytickou specifičnost a pokrytí.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo představit plně automatizovaný workflow pro analýzu HCP v léčebných proteinech kombinující:

• platformu Agilent AssayMAP Bravo pro přípravu a frakcionaci peptidů,
• LC-MS/MS systém Agilent 6545XT AdvanceBio Q-TOF se standardním průtokem,
• vendor-neutral software Protein Metrics (Byonic/Byologic) pro identifikaci a semikvantifikaci.

Workflow byl ověřen na modelu lidského IgG1 mAb spikovaného proteinovým mixem UPS2 v poměru 1:1 000 (w/w) a na kontrolním vzorku bez spikování.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation proběhla na platformě AssayMAP Bravo:

• redukce, alkylace a tryptické štěpení proteinu,
• desalting a vysokofázová (HPRP) frakcionace na RP-S cartridgích (6 frakcí, pH 10, krokový gradient acetonitrilu),
• automatizované plnění a vymývání cartridgí.

LC-MS/MS analýza:

• Agilent 1290 Infinity II LC System s AdvanceBio Peptide Plus kolónou (2,1 × 150 mm, 2,7 µm), 60min gradient, 0,4 mL/min, 60 °C,
• Agilent 6545XT AdvanceBio Q-TOF se zdrojem Dual Jet Stream ESI, MS rozsah 250–1 700 m/z, MS/MS rozsah 50–1 700 m/z, dynamická exkluze, úzká izolační šířka (~1,3 m/z),
• dvojí režim DDA: klasický Auto MS/MS a inovativní Iterative MS/MS pro opakované zařazování nízceobsažených prekurzorů.

Data processing:

• Byonic Preview pro optimalizaci hledacích parametrů,
• hledání proti databázi Uniprot CHO K1 rozšířené o sekvence mAb a UPS2,
• Byonic s nastavením semispecific trypsin, 20 ppm tolerance prekurzoru, 30 ppm fragmentu, fixní alkylace C, variabilní modifikace (ox. Met, deamidace),
• Byologic pro filtrování (min. skóre 150) a semikvantifikaci pomocí normalizovaného XIC.

Hlavní výsledky a diskuse

1) Iterative MS/MS versus Auto MS/MS (bez offline frakcionace):

• Iterative MS/MS zvýšilo počet unikátních peptidů detekovaných ze spikovaných proteinů (např. albumin: 46 vs. 43 peptidů),
• všechny proteiny nad 8 ppm byly identifikovány s vysokou důvěrou (min. 2 unikátní peptidy),
• vynikající reprodukovatelnost retence (RSD 1,2–10,3 %) i intenzit napříč třemi injekcemi.

2) On-cartridge HPRP frakcionace:

• 6 frakcí zlepšilo separaci peptidů a rozšířilo dynamický rozsah,
• všechny UPS2 proteiny nad 2 ppm byly detekovány (více než 3× více peptidů u nízceobsazených proteinů),
• identifikováno >138 endogenních CHO HCP vs. 38 bez frakcionace.

3) Semikvantifikace:

• normalizovaný XIC koreloval s naměřenou koncentrací spikovaných proteinů,
• workflow umožňuje odhad relativní abundance HCP bez standardních křivek.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí plně automatizovanou, vysoce reprodukovatelnou a citlivou platformu pro profilování HCP v bioterapeutikách. Umožňuje identifikaci i semikvantifikaci stopových proteinů v rozsahu jednotek ppm, podporuje splnění regulačních požadavků i validaci výrobních procesů. Díky modularity přístrojů a software lze workflow snadno rozšířit pro další typy analýz.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávají se další vylepšení v oblasti datově nezávislé akvizice (DIA), hlubší frakcionace a integrace umělé inteligence pro automatickou interpretaci spekter. Rozšíření cartridgí o specifické afinity (glykoproteiny, fosfoproteiny) a kombinace s kvantitativními stable-isotope technikami mohou dále zvýšit pokrytí a přesnost analýz HCP.

Závěr

Představený workflow propojuje automatizované mikrochromatografické zpracování vzorku, citlivou LC-Q-TOF akvizici s Iterative MS/MS a pokročilý softwarový nástroj pro důkladnou identifikaci a semikvantifikaci HCP. Metoda splňuje požadavky vysoké citlivosti, širokého dynamického rozsahu a reprodukovatelnosti potřebné pro QC bioterapeutik.

Reference

1. ICH Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products.
2. Agilent Technologies, Automation for LC/MS Sample Preparation: High Throughput In-Solution Digestion and Peptide Cleanup Enabled by the Agilent AssayMAP Bravo Platform, publication number 5991-2957EN.
3. Agilent Technologies, Automation of Sample Preparation for Accurate and Scalable Quantification and Characterization of Biotherapeutic Proteins Using the Agilent AssayMAP Bravo Platform, publication number 5991-4872EN.
4. Agilent Technologies, Agilent AssayMAP Bravo Technology Enables Reproducible Automated Phosphopeptide Enrichment from Complex Mixtures Using High Capacity Fe(III)-NTA Cartridges, publication number 5991-6073EN.