A Rapid and Economical Workflow for Protein Biomarker Discovery Using Agilent 6495D Triple Quadrupole LC/MS System

Význam tématu

Proteinové biomarkery jsou klíčovým nástrojem v klinické i výzkumné praxi. Rychlé a ekonomické workflow pro jejich objevování v komplexních biologických vzorcích, jako je lidská plazma, zkracuje dobu vývoje, optimalizuje náklady a podporuje cílené studie v oblasti QA/QC a průmyslové analytiky.

Cíle a přehled studie / článku

Tato proof-of-concept studie si klade za cíl demonstrovat rychlý a cenově efektivní postup pro identifikaci proteinových biomarkerů v lidské plazmě. Autoři využili veřejné databáze (Uniprot, PeptideAtlas), software Skyline s Agilent Automation pluginem a LC/TQ systém Agilent 6495D k vývoji MRM assay bez použití stabilně značených standardů. Vyvinutá metoda byla aplikována na plazmové vzorky 40 zdravých subjektů pro skupinovou analýzu (muži vs. ženy).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky lidské plazmy byly podrobeny noční trypsinové digesci a čištění peptideů pomocí platformy AssayMAP Bravo. Pro optimalizaci a kontrolu kvality byl připraven společný QC vzorek. LC separace probíhala na Agilent 1290 Infinity II Bio LC s kolonkou ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 (2,1×150 mm, 1,8 μm). Mobilní fáze: voda/0,1 % kyseliny mravenčí a acetonitril/0,1 % kyseliny mravenčí, gradient 25 minut, průtok 0,4 mL/min, teplota autosamplera 4 °C. Detekce na Agilent 6495D Triple Quadrupole Mass Spectrometer v režimu dMRM, celkem 3604 tranzic. Data byly zpracovány pomocí MassHunter a Skyline.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dMRM byla optimalizována během 2 dnů a zahrnula 846 peptidů reprezentujících 390 proteinů. Při vyhodnocení retenčních časů bez stabilně značených standardů dosáhlo 68 % peptidů přesného určení RT. Kontrolní QC injekce ukázaly medián CV 5,8 %, přičemž 91,7 % peptidů mělo CV < 20 %. Mezi jednotlivými běhy byl medián CV retenčního času 0,12 %. Skupinová analýza odhalila čtyři proteiny s významnými rozdíly mezi muži a ženami, přičemž dva tyto nálezy odpovídají literatuře. Synchronní expresní vzory tří peptidů těhotenské zónové bílkoviny (PZP) potvrdily vysokou reprodukovatelnost kvantifikace.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá příprava a optimalizace metody pomocí Skyline a Agilent Automation pluginu
• Kvantifikace bez nutnosti stabilně značených peptidů s nízkými náklady
• Vysoká citlivost, přesnost a reprodukovatelnost ve velkých kohortách
• Kompletní analýza 846 peptidů během 25 minutového LC/MS cyklu

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vylepšení může spočívat v integraci stabilně značených standardů pro přesnější retenční časy, rozšíření studií na větší populační skupiny, plné automatizaci workflow a využití umělé inteligence pro návrh a analýzu MRM metod. Metoda lze adaptovat pro různé biologické matice a klinické aplikace.

Závěr

Prezentovaný workflow na platformě Agilent 6495D LC/TQ nabízí rychlou, citlivou a nákladově efektivní cestu k objevování proteinových biomarkerů v lidské plazmě bez potřeby stabilně značených peptidů. Metoda vykazuje vysokou reprodukovatelnost a vhodnost pro preklinický výzkum i průmyslové aplikace.

Reference

1. Gaither C, et al. Determination of the concentration range for 267 proteins from 21 lots of commercial human plasma using highly multiplexed multiple reaction monitoring mass spectrometry. Analyst. 2020