Developing a Quantitative Surrogate Peptide Assay – Peptide mapping through MRM Optimization for Measuring Dulaglutide in a Rat PK Study

Význam tématu

Rychlý vývoj kvantitativních LC-MS/MS metod pro fúzní proteiny je klíčový pro preklinické i klinické studie léčiv. Díky citlivé a selektivní analýze surrogate peptidů lze spolehlivě monitorovat koncentrace bioterapeutik, jako je dulaglutid, v biologických matricích.

Cíle a přehled studie / článku

Prezentovaná aplikace popisuje univerzální workflow pro vývoj kvantitativního MRM assay pro Fc-obsahující fúzní proteiny. Metoda byla ověřena na dulaglutidu a aplikována v ratím farmakokinetickém (PK) studiu s dosažením LLOQ 1 ng/mL.

Použitá metodika

• Peptidové mapování k určení vhodných surrogate peptidů
• Automatizovaná optimalizace MRM přechodů pomocí MassLynx Skyline Interface
• Imunopurifikace, tryptická digesce a selektivní SPE příprava vzorků
• Validace citlivosti, linearity a přesnosti metody v ratí plasma vzorcích

Použitá instrumentace

• LC: ACQUITY UPLC I-Class PLUS
• HRMS: Xevo G2-XS QTof pro peptide mapping
• TQ-MS: Xevo TQ-XS pro kvantitativní MRM analýzu
• Software: UNIFI (v.1.9.4), MassLynx Skyline Interface

Hlavní výsledky a diskuse

Peptidové mapování dosáhlo 93% sekvenční pokrytí a identifikovalo 15 tryptických peptidů. Po filtru délky a modifikací bylo vybráno 7 vhodných surrogate peptidů. Automatizovaný MSI workflow určil a optimalizoval MRM přechody, optimalizoval kolizní energie a naplánoval retence. Metoda pro ratí PK vzorky vykázala LLOQ 1 ng/mL, linearitu 1–10 000 ng/mL (r2>0,99), přesnost QC vzorků v rámci ±15 % a CV <7 %. PK profil ukázal poločas rozpadu HGEG peptidu 22,9 h, zatímco GLPS peptid vykazoval zhruba trojnásobně delší poločas.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení času vývoje kvantitativní metody
• Vysoce citlivá a selektivní detekce dulaglutidu v plazmě
• Robustní workflow vhodný pro preklinické PK studie a bioanalytické laboratoře

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření workflow na další fúzní proteiny a monoklonální protilátky
• Integrace HRMS a TQ-MS řešení pro multiplatformní kvantifikaci
• Další automatizace přípravy vzorků a datové analýzy pro vysokopropustné aplikace

Závěr

Popsaný workflow pro peptide mapping, MSI MRM optimalizaci a citlivou přípravu vzorků umožnil vyvinout robustní kvantitativní LC-MS/MS metodu pro dulaglutid. Metoda splňuje kritéria vysoké citlivosti, linearity a přesnosti a je aplikovatelná v preklinických PK studiích.

Reference

• Dunning CM, Wrona MD. How to Maximize Bioanalytical Performance of Fc-Fusion Proteins: Practical Sample Preparation and LC-MS/MS Workflows for Dulaglutide Quantification from Plasma. Waters Application Note 720006823EN.
• Kellie JF, Kehler JR, Szapacs ME. Application of High-Resolution MS for Development of Peptide and Large-Molecule Drug Candidates. Bioanalysis. 2016;8(3):169–177.
• Skyline targeted mass spec environment. University of Washington; 2020.
• Zhang Y, Huo M, Zhou J, Xie S. PKSolver: An Add-In Program for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Data Analysis in Microsoft Excel. Comput Methods Programs Biomed. 2010;99(3):306–314.
• Australian Public Assessment Report for dulaglutide rch. TGA; 2015.
• Center for Drug Evaluation and Research. Pharmacology Review of dulaglutide. FDA; 2013.
• Kang L et al. Simultaneous Catabolite Identification and Quantitation of Large Therapeutic Protein at the Intact Level by Immunoaffinity Capture LC-HRMS. Anal Chem. 2017;89(11):6065–6075.