Quantification of Human Papillomavirus (HPV) Antigens in the Nonavalent Vaccine GARDASIL 9

Význam tématu

Správná kvantifikace a potvrzení identity antigenů v očkovacích látkách je klíčová pro zajištění bezpečnosti a účinnosti vakcín během procesu uvolnění šarží. Tradiční imunochemické metody často trpí nízkou selektivitou, časovou náročností vývoje a omezenými multiplexními schopnostmi. Využití LC–MS/MS s metodou náhradních peptidů umožňuje rychlou a selektivní simultánní analýzu více proteinových antigenů v komplexních matricích.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a validovat kompletní pracovní postup pro kvantitativní stanovení devíti typově specifických HPV L1 proteinů přítomných v nonavalentní vakcíně GARDASIL 9. Studie zahrnovala optimalizaci desorpce proteinů z adjuvantu, tryptickou digesci, peptide mapping a kvantitativní LC–MS/MS analýzu s využitím surrogate peptide přístupu v jednom sedmiminutovém běhu.

Použitá instrumentace

• Kapalinový chromatograf ACQUITY UPLC I-Class PLUS
• Masový spektrometr Xevo TQ-S micro (pro kvantifikaci) a Xevo G2-XS QTof (pro peptide mapping)
• Kolony ACQUITY PREMIER Peptide BEH C18 300 Å, 1,7 µm, 2,1 × 100 mm
• Vzorkové destičky QuanRecovery s MaxPeak High Performance Surfaces
• Software MassLynx v4.2, TargetLynx XS v4.2 a UNIFI v1.9.4

Použitá metodika

Vzorky vakcíny byly nejprve zpracovány desorpcí proteinů z amorfního hydroxofosfát sulfátového adjuvantu pomocí surfaktantu RapiGest při pH 10,0, což umožnilo úplné odpojení a denaturaci VLP částic. Následovala redukce, alkylace a digesce pomocí trypsinu za poměru enzym:substrát 1:10 při 37 °C přes noc. Peptidové části byly charakterizovány pomocí LC–MSE peptide mappingu a vybrány surrogate peptidy pro každou HPV štěpinu. Finální MRM metodu vznikla optimalizací kolizní energie a výběrem nejintenzivnějších b/y fragmentů.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala lineární kvantifikaci devíti HPV L1 proteinů v rozsahu 10–200 µg/mL s intradení i mezidení přesností (CV < 8 %) a shodou se značenými hodnotami. Porovnání běžné a PREMIER kolony ukázalo až dvojnásobné zvýšení plošného signálu a rychlejší pasivaci díky technologii MaxPeak HPS. Dále bylo potvrzeno, že kompletní desorpce adjuvantu vyžaduje vysoké pH a MS-kompatibilní surfaktant a že optimální digesce nastává při poměru trypsin:protein 1:10 po 16 hodinách.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednoranná simultánní kvantifikace devíti antigenů zkracuje dobu analýzy a zvyšuje laboratorní propustnost
• Zvýšená selektivita a citlivost oproti tradičním imunotestům
• Šetrný postup desorpce zachovává integritu VLP a minimalizuje interferenci adjuvantu
• Vysoká reprodukovatelnost podporuje spolehlivé uvolňování šarží vakcíny

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření přístupu na další očkovací látky a složitější antigenové směsi
• Automatizace a miniaturizace přípravných postupů pro vysokopropustné platformy
• Integrace datové analýzy s umělou inteligencí pro prediktivní hodnocení kvality vakcín
• Vývoj multiplexních panelů pro současné sledování imunogenních a stabilizačních komponent

Závěr

Vyvinutá LC–MS/MS metoda s elegantním pracovním postupem pro desorpci adjuvantu, tryptickou digesci a surrogate peptide kvantifikaci poskytuje rychlý, přesný a robustní nástroj pro kontrolu kvality nonavalentní HPV vakcíny. Metoda splňuje požadavky na přesnost, linearitu i reprodukovatelnost a je připravena pro rutinní použití v QC laboratořích.

Reference

1. Clifford GM, Smith JS, Aguado T, Franceschi S. Comparison of HPV Type Distribution in High-Grade Cervical Lesions and Cervical Cancer: A Meta-Analysis. Br J Cancer. 2003;89(1):101–5.
2. NIH National Cancer Institute. Human Papillomavirus (HPV) Vaccines. 2020.
3. Dunning CM, Wrona MD. Developing a Quantitative Surrogate Peptide Assay – Peptide mapping through MRM Optimization for Measuring Dulaglutide in a Rat PK Study. Waters Application Note 720006969EN.
4. Tanna N, Dunning CM, Molloy B. MassLynx-Skyline Interface (MSI) – A New Automated Tool to Streamline MRM Method Development and Optimization for Large Molecule Quantification. Waters Application Note 720006813EN.
5. Lauber M et al. Low Adsorption HPLC Columns Based on MaxPeak High Performance Surfaces. Waters White Paper 720006930EN.
6. Hem SL, Hogenesch H. Relationship Between Physical and Chemical Properties of Aluminum-Containing Adjuvants and Immunopotentiation. Expert Rev Vaccines. 2007;6(5):685–98.
7. FDA. GARDASIL 9 Package Insert. 2020.
8. Caulfield MJ et al. Effect of Alternative Aluminum Adjuvants on the Absorption and Immunogenicity of HPV16 L1 VLPs in Mice. Hum Vaccin. 2007;3(4):139–45.
9. Wibom C. pI Predictor. Umeå University. 2020.
10. Mistry N, Wibom C, Evander M. Cutaneous and Mucosal Human Papillomaviruses Differ in Net Surface Charge, Potential Impact on Tropism. Virol J. 2008;5:118.
11. McCarthy MP et al. Quantitative Disassembly and Reassembly of HPV Type 11 VLPs In Vitro. Virology. 1998;72(1):32–41.