Method Development Tools for More Efficient Screening of Biopharmaceutical Method Conditions Using the ACQUITY Arc Bio SystemPart 1 of 2: Screening Multiple RPLC Columns for High Throughput Analysis

Význam tématu

Reverzní fázová kapalinová chromatografie (RPLC) je klíčová v analytických laboratořích pro separaci peptidů a bílkovin. S rostoucí komplexitou vzorků a širokou nabídkou kolonních chemistrií je náročné rychle identifikovat optimální podmínky. Efektivní screening více kolon a parametrů mobilních fází zkracuje dobu vývoje metod a zvyšuje kvalitu výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

V první části aplikace autoři demonstrovali využití systému ACQUITY Arc Bio s modulárními „column manager“ jednotkami pro automatické přepínání čtyř RPLC kolon během jednoho běhu. Sledovaly se čtyři odlišné chemistrie (BEH C18, CSH C18, HSS T3 C18, CORTECS C18) v mobilních fázích s 0,1 % TFA a 0,1 % FA. Cílem bylo porovnat kapacitu, tvar a selektivitu eluce za použití ACQUITY QDa hmotnostního detektoru.

Použitá metodika a instrumentace

• Systém: ACQUITY Arc Bio System s moduly CM-A a CM-Aux
• Detekce: UV/Vis detector 2489 (214 nm) + ACQUITY QDa Mass Detector (ESI+, 300–1250 Da)
• Kolony: XBridge BEH C18 (130 Å, 2,5 µm), XSelect CSH C18 (130 Å, 2,5 µm), XSelect Peptide HSS T3 C18 (100 Å, 2,5 µm), CORTECS C18 (90 Å, 2,7 µm)
• Vzorky: MassPREP Peptide Mixture (~15 µg/mL) a NIST mAb Tryptic Digestion Standard (~0,5 µg/µL)
• Mobilní fáze: voda/acetonitril s 0,1 % TFA nebo 0,1 % FA, gradient 0,5–45 % B (20 min pro peptidovou směs, 60 min pro mAb digest)
• Software: Empower 3 pro řízení přepínání kolon a správu dat

Hlavní výsledky a diskuse

• TFA poskytla vyšší kapacitu a užší píky ve srovnání s FA, ta však vykazovala větší citlivost v MS.
• Největší retence vykazovala HSS T3, nejnižší CORTECS.
• U modelové peptidové směsi došlo k obrácenému pořadí eluce enolase T37 a melittin mezi TFA a FA a ke koeluci v FA na CORTECS.
• U mAb digestu koelovaly peptidy L10 a H26 v FA, ale byly rozdělené v TFA; rovněž se měnilo pořadí eluce H15 a H4.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizované přepínání kolon a paralelní sledování UV/Vis a MS detekcí umožňuje rychlý screening nejvhodnější kombinace kolony a mobilní fáze s minimální obsluhou. Metoda nachází uplatnění v kvalitativní i kvantitativní kontrole biofarmaceutických produktů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření systému o další CM-Aux jednotky pro testování až šesti kolon.
• Integrace automatické přípravy pufrů a rozšíření na SEC a IEX chromatografii.
• Využití umělé inteligence pro optimalizaci přepínacích a gradientních podmínek.
• Adaptace na analýzu složitějších biologických makromolekul a malých molekul.

Závěr

Systém ACQUITY Arc Bio s modulárním přepínáním kolon a ACQUITY QDa detektorem efektivně akceleruje vývoj RPLC metod. Kombinované vyhodnocení kapacity i selektivity eluce napomáhá výběru optimální kolony a mobilní fáze pro daný analyzovaný vzorek.

Reference

Koza S.M., Chambers E.E. Selecting a Reversed-Phase Column for the Peptide Mapping Analysis of a Biotherapeutic Protein. Waters Application Note, 720005924EN, 2017.