Comprehensive and Robust Proteome Profiling using Online-2D NanoLC coupled to the Orbitrap Exploris 480 MS

Význam tématu

Vysokokapacitní a spolehlivé hloubkové profilování proteomu je klíčové pro biomedicínský výzkum a klinickou diagnostiku. Kombinace dvoufázové online nanolitrové kapilární chromatografie (online 2D-nanoLC) s vysoce výkonnou hmotnostní spektrometrií Orbitrap Exploris 480 umožňuje dosáhnout vyšší proteomické pokrytí než jednorozměrné přístupy. Tato metoda zkracuje dobu analýzy, redukuje manipulaci se vzorkem a minimalizuje ztráty, což je zásadní pro analýzu omezených či hodnotných biologických vzorků.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem studie bylo vyvinout a validovat jednoduchou online 2D-nanoLC platformu kombinující vysoko-pH reverzní fázi (1. dimenze) a nízko-pH reverzní fázi (2. dimenze) s Orbitrap Exploris 480 MS. Autoři porovnali různé režimy frakcionace (2, 4, 8 frakcí) na vzorcích HeLa digestu a lidské sérové bílkoviny a ověřili reprodukovatelnost a hloubku proteomického pokrytí.

Použitá metodika a instrumentace

Online 2D-nanoLC systém:

• První dimenze: Monolitická kapilární PepSwift kolona (100 µm × 250 mm) při pH 8,0 (50 mM NH4HCO3).
• Trapovací kolony: Dvě C18 kolony pro zachycení frakcí každých 45 minut.
• Druhá dimenze: EASY-Spray kolona (75 µm × 150 mm) při pH 3,0 (0,1 % FA).
• MS: Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480 v režimu Data Dependent Acquisition (DDA).

Extrakce a příprava vzorku:

• HeLa proteinový digest rekonstituován v 0,1 % FA.
• Serum: Precipitace methanolem, trypsinová digesce bez redukce/alkylace, čištění na HyperSep C18 kartáži.

Data analýza:

• Proteome Discoverer 2.2, vyhledávání proti SwissProt lidskému databázi.
• Parametry: Prekurzorová tolerance 10 ppm, fragmentační tolerance 20 mmu, FDR <1 %.

Hlavní výsledky a diskuse

Rozdělení frakcí a využití MS:

• Metoda 8-frakcí vykázala rovnoměrné rozdělení peptidů a vysokou ortogonalitu mezi dimenzemi (~91 % jedinečných peptidů na frakci).
• MS využití až 88 % u 8-frakčního režimu, proporční zvýšení počtu identifikovaných peptidů a proteinů s rostoucím počtem frakcí.

Hloubkové profilování:

• HeLa vzorek: Lineární nárůst identifikací při přechodu z 2 na 8 frakcí.
• Sérum: Zvýšení počtu proteinových skupin o 30 % (2→4 frakce) a 28 % proteinů a 14 % peptidů při přechodu na 8 frakcí.
• Analýza 15 sérových vzorků 4-frakční metodou během ~57 h vedla k průměru 321 proteinových a 3658 peptidových skupin na vzorek s vysokou reprodukovatelností TIC.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizovaná online platforma bez manuální manipulace po digesci.
• Vysoká kompatibilita s různými matrícemi včetně lidského séra.
• Efektivní alternativa dlouhým jednorozměrným LC-MS analýzám při shotgun proteomice.
• Možnost hlubšího profilování omezeného množství vzorku a velkých vzorekohromad.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace s rychlejšími MS analyzátory a vylepšenými softwarovými nástroji pro kvantitativní analýzu, včetně DIA (data independent acquisition). Rozšiřování počtu frakcí a optimalizace gradientů umožní ještě hlubší charakterizaci komplexních biologických vzorků a post-translačních modifikací. Tato technologie může být klíčová pro biomarkerové studie a personalizovanou medicínu.

Závěr

Popsaná online 2D-nanoLC-MS metoda poskytuje robustní, vysokoproduktivní a reprodukovatelné proteomické analýzy s hlubokým pokrytím. Automatizace, minimalizace ztrát vzorku a vysoké MS využití dělají z této platformy atraktivní volbu pro náročné aplikace v oblasti biomedicíny, farmacie a klinické proteomiky.

Reference

1. Boychenko A., Pynn C., Arrey T., Zheng R., Decrop W., Jehle P. Tailored high-throughput low-flow LC-MS methods for large scale sample cohort analysis. Thermo Scientific Technical Note 73208.
2. Osorio D., Rondón-Villarreal P., Torres R. Peptides: Calculate indices and theoretical physicochemical properties of peptides and protein sequences. R Package Version 2.2.
3. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria.
4. Carr D., Lewin-Koh N., Maechler M. Hexagonal Binning Routines. 2019.