Tandem UHPLC operation for high-throughput LC-MS peptide mapping analyses

Význam tématu

Vysokoprůtokové LC-MS peptide mapping metody jsou nezbytné pro detailní charakterizaci bioterapeutik, jako jsou monoklonální protilátky. Optimalizace doby reekvilibrace kolon a paralelní provoz dvou kol umožňují významné zvýšení produktivity bez kompromisů v kvalitě separace.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat použití systému Thermo Scientific Vanquish Duo pro tandemový provoz dvou UHPLC kolon. Studie ukazuje, jak lze stávající, validované gradientní metody rozšířit o paralelní reconditioning bez prodloužení celkového běhu a bez nutnosti dalšího laboratorního prostoru.

Použitá metodika

Vzorek infliximabu byl zpracován pomocí SMART Digest kitu s imobilizovaným trypsinem při 70 °C po dobu 45 minut. Po centrifugaci a doplnění kyselinou mravenčí byl na kolonu aplikován proteomický gradient. Jedna kolona byla v daném okamžiku napojena na MS detekci, zatímco druhá byla offline proplachována a reekvilibrována.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Horizon Duo UHPLC systém
• 2× Binary Pump H, Split Sampler HT, Column Compartment H, Variable Wavelength Detector F
• Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS se zdrojem HESI-II
• SMART Digest Kit, Acclaim VANQUISH C18 kolony 2.1×250 mm, 2.2 μm

Hlavní výsledky a diskuse

Tandemový provoz umožnil až 40% nárůst průtoku vzorků při zachování původního gradientu. Retenční časy knihovně peptidů vykázaly RSD pod 0,11 % a plošné RSD kolem 2,5 %. Paralelní recondition­ing výrazně snížil carry-over a prokázal stabilitu opakovaných běhů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje zvýšit výkon laboratoří bez dodatečné prostorové ani personální náročnosti. Stávající validované metody lze upravit pomocí softwarového průvodce v Chromeleon bez zásahu do chromatografického profilu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření tandemových LC systémů do dalších oblastí proteomiky, metabolomiky a QC biotherapeutik. Další optimalizace fluidních cest, integrace s automatizovanými moduly vzorkování a využití pokročilých algoritmů pro plánování běhů podpoří další zkrácení celkového času analýzy.

Závěr

Systém Vanquish Duo pro tandemový provoz potvrzuje možnost výrazného zvýšení throughputu v peptide mappingu při zachování vysoké reproducibility a bez nutnosti nových metodických validací.

Reference

1. Fletcher MR, Foley JP. Kinetic Model of HPLC Column Re-Equilibration after Gradient Elution. Eastern Analytical Symposium 2015.
2. Van Middlesworth BJ, Dorsey JG. Re-equilibration Time of Superficially Porous Silica Based Columns in Gradient Elution Reversed Phase LC. J Chromatogr A. 2011;1218(40):7158–65.
3. Freiser HH, Nowlan MP, Schmuck MN. The Use of Stabilized Silica Support with a Short Alkyl Chain for Preparative Chromatography of Proteins. Micra Scientific, 1988.