Consistent results for peptide mapping and monitoring across three systems of the Vanquish UHPLC platform

Význam tématu

Peptidové mapování a monitorování klíčových posttranslačních modifikací proteinových bioterapeutik patří mezi základní kroky při vývoji a kontrole kvality léčiv na bázi proteinů. Spolehlivé stanovení retenčních časů, přesné kvantitativní výsledky a reprodukovatelnost mezi laboratorními platformami umožňují vysokou důvěru v identifikaci a sledování terapeutických proteinů napříč vývojovým cyklem.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo porovnat konzistenci, reprodukovatelnost a přenositelnost metod peptidového mapování a monitorování na třech systémech Thermo Scientific Vanquish UHPLC platformy: Horizon, Flex Binary a Duo v režimu Tandem LC-MS. Testovány byly dva proteinové digesty (BSA se 30min gradientem, NISTmAb se 90min gradientem), každý s deseti replikami, přičemž experimenty se opakovaly po dvou týdnech.

Použitá metodika a instrumentace

Pro oba vzorky byla použita standardní příprava: redukce, alkylace a tryptické štěpení. Chromatografie probíhala na dvou identických Acclaim Vanquish C18 kolonkách (2,1×250 mm, 2,2 µm). Metody byly nastaveny na flow 0,3 ml/min, teplotu kolony 25 °C a rozlišení gradientů podle délky separace. Detekce byla prováděna na Q Exactive Plus Orbitrap MS v režimu data-dependent (peptidové mapování) a Full MS pro cílené monitorování. Data se zpracovávala ve BioPharma Finder 4.1 pro tvorbu cílových workbooků a poté v Chromeleon CDS 7.3 s ICIS MS algoritmem pro kvantifikaci PQAs.

Použitá instrumentace

• Vanquish Horizon UHPLC (max. tlak 1500 bar).
• Vanquish Flex Binary UHPLC (LPG pumpy, průtok do 8 ml/min, tlak 1000 bar).
• Vanquish Duo UHPLC pro Tandem LC-MS (dvě binární pumpy, paralelní analytická a recondiční kolona).
• Q Exactive Plus hybridní kvadrupól-Orbitrap MS.
• Chromeleon Chromatography Data System verze 7.3.
• BioPharma Finder Software verze 4.1.

Hlavní výsledky a diskuse

- Retenční časy mezi systémy Horizon a Duo byly takřka identické. Flex systém vykazoval u BSA 30min gradientu konstantní posun ~46 s díky vyššímu gradient delay volume (GDV), který na delších 90min gradientech už do kvantifikace nevstupuje významně.
- Rozdíl v GDV lze kompenzovat buď isokratickou pauzou na začátku metody, nebo výměnou gradientového mixéru/kolonek za komponenty s nižším GDV.
- Peptidová sekvenční pokrytí všech systémů bylo 100 % pro těžký řetězec NISTmAb a téměř 99 % pro lehký řetězec.
- Reprodukovatelnost retenčních časů (CV ≤ 0,2 %), šířky píků (CV ≤ 10 s) a kvantifikace post-translačních modifikací (CV ≤ 10 %) byla vynikající pro všechny platformy i za dvoutýdenního intervalu.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizovaný přenos metod mezi třemi systémy Vanquish UHPLC usnadňuje práci v prostředí QA/QC a mezi odděleními.
• Režim Tandem LC-MS na Vanquish Duo zvýšil propustnost až o 46 % bez kompromisů v kvalitě dat.
• Spolehlivá kvantifikace nízkoodběrných modifikací (<1 %) umožňuje detailní MAM workflow.

Budoucí trendy a možnosti využití

- Integrace dalších detektorů (UV, FLD) a modulů automatického screeningu může dále zrychlit metodický scouting.
- Využití AI-řízené optimalizace gradientů a prediktivních modelů pro předem nastavené kompenzace GDV.
- Rozšíření platformy o vyšší průtokové režimy pro rychlé screeningové aplikace v průmyslové kvalitativní analýze.

Závěr

Porovnání tří Vanquish UHPLC systémů pro peptidové mapování a monitorování prokázalo vysokou konzistenci a přenositelnost metod. Vanquish Horizon, Flex a Duo nabízejí vyrovnanou přesnost retenčních časů, šířky píků a kvantifikaci modifikací. Hardware či metodické úpravy mohou kompenzovat rozdíly v GDV, což usnadňuje implementaci MAM workflow v globálním měřítku.

Reference

1. Thermo Scientific Case Study 000565: Metodický přenos v LC.
2. Thermo Scientific Case Study 000566: Transfer metod na platformu Vanquish.
3. Thermo Scientific Application Note 73784: High-throughput peptide mapping trastuzumabu.
4. Thermo Scientific Application Note 72203: Tandem UHPLC operace pro LC-MS peptidové mapování.