UHPLC Optimization Study for Improved LC-MS Performance and Throughput

Význam tématu

Vysokovýkonná kapalinová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií (UHPLC-MS) je klíčová pro analýzu složitých vzorků v environmentální ochraně, potravinářské bezpečnosti, farmaceutickém výzkumu i průmyslové kontrole kvality.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat tři varianty UHPLC systémů Thermo Fisher Vanquish (Horizon, Flex Binary, Flex Quaternary) z hlediska chromatografického výkonu, přesnosti retenčních časů, kvality tvaru piků a celkové denní kapacity vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

Pro testování byla připravena směs 11 pesticidů (mepiquat chloride, methamidofos, carbendazim, fenuron, carbofuran, fluometuron, metazachlor, metalaxyl, boscalid, uniconazole, quinoxyfen) ve vodném roztoku s mobilními fázemi:

• Fáze A: voda s 55 mM formiátovým pufrem a 0,1 % kyselinou mravenčí
• Fáze B: methanol s 55 mM formiátovým pufrem a 0,1 % kyselinou mravenčí

Chromatografické systémy a podmínky:

• Vanquish UHPLC, Flex Binary, Flex Quaternary
• Kolony Thermo Scientific Hypersil GOLD 100×2,1 mm (1,9 μm), 50×2,1 mm (1,9 μm) a Accucore Vanquish C18+ 100×2,1 mm (1,5 μm)
• Teplota kolony 40 °C, objem injekce 11 μL, průtok 0,5 mL/min
• Pět lineárních gradientů 5–95 % B v časech 2, 5, 10, 20 a 100 minut
• Mass spektrometr Velos Pro s HESI-II ionizační hlavicí v pozitivním módu

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace mixeru:

• Test mixovacích objemů od 25 do 100 μL pro quaternary systém ukázala, že 35 μL mixovací objem zajistí stabilní pumpní šum a kvalitní tvar píků

Retenční časy a přesnost:

• Průměrná odchylka retenčního času (SD) byla pod 0,001 min (60 ms), v průměru 53 ± 20 ms pro systém Horizon a 82 ± 31 ms pro Flex Binary
• Nejvyšší přesnost a nejnižší šum zaznamenán u polaritně rozdílných pesticidů (např. methamidofos, quinoxyfen) na HPG systémech

Výkon a průtok vzorků:

• HPG (vysokotlaký gradient) systémy dosáhly 199 vzorků/den při 2minutovém gradientu oproti 144 vzorkům/den u LPG (nízkotlaký gradient)
• Použitím Accucore Vanquish C18+ kolony (1,5 μm) a zvýšením provozního tlaku na 1 300 bar bylo dosaženo 275 vzorků/den
• Ultrarychlý gradient 1,85 min umožnil zpracovat až 567 vzorků/den při zachování rozlišení a opakovatelnosti tvaru píků

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizované UHPLC-MS protokoly poskytují:

• Vysokou přesnost a opakovatelnost retenčních časů pro různé třídy látek
• Flexibilitu výběru pumpovacího systému podle požadavků na rychlost vs. šířku gradientu
• Možnost výrazného navýšení denní kapacity analýz bez kompromisu kvality

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj:

• Integrace ultrarychlých gradientů pro masivní vysokokapacitní skríning
• Využití inteligentního řízení GDV (gradient delay volume) k optimalizaci automatizovaných přechodů mezi běhy
• Rozšíření do kombinovaného HRAM-MS a MRM režimu pro komplexní charakterizaci vzorků

Závěr

Volba UHPLC systému by měla vycházet z poměru požadované propustnosti, přesnosti retenčních časů a maximálního provozního tlaku. Pro delší gradienty nad 25 minut se osvědčil systém Flex Quaternary s 35 μL mixovacím objemem. Pro vysokokapacitní a velmi krátké gradienty (<5 min) mají výhodu HPG pumpy. Pro univerzální rutinní analýzy do 1 000 bar lze doporučit Flex Binary systém, zatímco pro maximální propustnost a spolehlivost ve všech podmínkách je nejlepší volbou 1 500barový Vanquish systém.