Characterization of Monoclonal Antibodies Oxidation Variants Using Middle-down Approach and Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) jsou klíčovou třídou bioterapeutik s rostoucím významem v klinické praxi. Jejich komplexní struktura a posttranslační modifikace vyžadují vysoce rozlišovací metody pro kvalitativní kontrolu a zajištění biologické aktivity.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlý a univerzální LC/MS workflow pro separaci a charakterizaci intactních mAb fragmentů (LC, HC, Fc, Fab, scFc, F(ab´)2) a detekci oxidativních variant včetně lokalizace modifikací. Studie kombinuje middle-down přístup s hydrogen/deuterium exchange (HDX) analýzou.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika vychází z middle-down přístupu a kombinuje:

• Redukci mAb pomocí DTT pro oddělení lehkého a těžkého řetězce
• Štěpení papainem k získání fragmentů Fab, Fc a scFc
• Štěpení proteázou IdeS pro generaci fragmentů scFc a F(ab´)2
• Reverzní fázovou chromatografii na SMP RP (MAbPac RP) sloupci (4 µm, 3×50 mm) s 10min gradientem H2O/MeCN/FA/TFA
• MS analýzu Orbitrap Q Exactive Plus (17 500 rezoluce) pro intactní fragmenty
• HDX-MS analýzu s H/D-X PAL automatizací, Dionex UltiMate 3000 a Orbitrap Fusion Tribrid (60 000 rezoluce)

Hlavní výsledky a diskuse

• Baseline separace LC, HC, Fc, Fab, scFc a F(ab´)2 fragmentů během 10min gradientu
• Přesné určení hmotnosti oxidovaných variant s plným rozlišením oxidované a neoxidované HC
• HDX-MS odhalila zvýšenou kinetiku deuterium uptake v oblasti Met255 po oxidaci
• Zvýšená přístupnost solventu v místě oxidace potvrzena rozdílným profilem deuteration

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé screeningové vyhodnocení mAb variant v QC a vývoji
• Možnost lokalizace a kvantifikace oxidativních modifikací bez plného mapování peptidů
• Flexibilní workflow spojující intactní hmotnostní analýzu a HDX-MS pro detailní strukturální informace

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s glyko-profilováním a dalšími PTM analýzami v online režimu
• Automatizace middle-down workflow pro zvýšení throughputu a reproducibility
• Rozšíření aplikace na různé třídy protilátek a konjugáty
• Využití strojového učení pro interpretaci HDX dat a predikci conformačních změn

Závěr

Prezentovaná metoda nabízí rychlou a robustní separaci stejně jako přesnou charakterizaci mAb fragmentů a jejich oxidativních variant. Kombinace SMP RP LC a vysoce rozlišovacího Orbitrap MS s doplňkovou HDX-MS analýzou přináší komplexní pohled na modifikace a strukturální vlastnosti.

Reference

• Liu H., Gaza-Bulseco G., Zhou L. Mass Spectrometry Analysis of Photo-Induced Methionine Oxidation of a Recombinant Human Monoclonal Antibody. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2009, 20, 525-528