A highly sensitive and robust 150 μm column to enable high-throughput proteomics

Význam tématu

• Proteomika vyžaduje citlivé a robustní chromatografické metody pro analýzu složitých biologických vzorků.
• Kapilární LC separace ve formátu 15 cm × 150 μm podporuje vysokou propustnost a stabilitu pro rozsáhlé studie.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje a ověřuje výkon nové 150 μm kapilární EASY-Spray PepMap C18 kolony (2 μm, 15 cm) v kombinaci s Q Exactive HF-X Orbitrap hmotovým spektrometrem a optimalizovaným DDA+ workflow pro vysokoprocesní a vysoce citlivou proteomiku. Cílem je ukázat reprodukovatelnost, robustnost (>1000 injekcí) a vysoce přesnou kvantifikaci bílkovin v heLa digestech.

Použitá metodika a instrumentace

Instrumentace:

• Kapilární LC systém Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLCnano s EASY-Spray zdrojem a nástrojem nanoViper pro připojení k MS.
• Kolona Thermo Scientific EASY-Spray PepMap C18, 2 μm, 15 cm × 150 μm i.d.
• Mass spektrometr Q Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap v režimu DDA+.
• Software Proteome Discoverer 2.2 s moduly Feature Mapper, Precursor Ions Quantifier a Minora Feature Detector.

Metodika:

• Low-flow profilování (1.2 μL/min, gradient 59 minut) a high-flow cílené analýzy (3 μL/min, gradient 15 minut).
• Mobilní fáze: voda a acetonitril, obě s 0.1 % kyseliny mravenčí.
• Standardy: HeLa protein digest, PRTC směs pro kalibraci retenčního času.
• MS podmínky: rozlišení 120 000 pro MS a 7 500 pro MS/MS, NCE 28, rozsah 350–1400 m/z, dynamická exkluze 20 s.

Hlavní výsledky a diskuse

Reprodukovatelnost:

• Mezi třemi kolony byla dosažena retenční RSD <3 % a zpětný tlak v rámci 3 %.
• Intra-kolonová retence RSD <0.5 % při 20 po sobě jdoucích bězích.

Robustnost:

• Stabilní výkon po 1000 injekcích heLa digestu s proteomovou pokrytím >4500 proteinů a ~30 000 peptidů.
• Kvantifikační přesnost RSD <5 % celkově a <20 % u jednotlivých proteinových skupin.

Přínosy a praktické využití metody

• Snadné „plug-and-spray“ připojení kolony zkracuje dobu přípravy.
• Vyvážená citlivost a odolnost podporuje velkokapacitní studie bez ztráty výkonu.
• Kompatibilita s různými režimy LC-MS umožňuje flexibilní nastavení podle požadavků experimentu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zkracování gradientů pro ultra vysokou propustnost v klinických a průmyslových laboratořích.
• Integrace s automatizovanými nasávacími systémy pro zpracování stovek vzorků bez manuální obsluhy.
• Využití strojového učení pro predikci optimálních podmínek separace a zpracování dat.

Závěr

Nová kapilární EASY-Spray kolona 15 cm × 150 μm přináší vynikající reprodukovatelnost, citlivost a trvanlivost pro vysokoprocesní proteomiku. Ve spojení s Q Exactive HF-X MS a DDA+ workflow poskytuje spolehlivou a standardizovanou platformu pro rozsáhlé analýzy proteinů.

Reference

1. Thermo Fisher Scientific. Pushing the leading edge in protein quantitation: Integrated, precise, and reproducible proteomic workflows. 2017.
2. Thermo Fisher Scientific. Increased sample throughput with a capillary EASY-Spray column. 2017.