High-throughput quantitative proteomics with Evosep Eno and the Orbitrap Astral Zoom Mass Spectrometer

Význam tématu

Studium vysokopropustné kvantitativní proteomiky je klíčové pro velké klinické kohorty, screeningy léčiv a systémovou biologii, kde je nutné dosahovat hlubokého a reprodukovatelného pokrytí proteomu při vysokém počtu vzorků. Kombinace robustní chromatografie a rychlé, citlivé hmotnostní spektrometrie umožňuje zachovat přesné kvantitativní metriky bez oběti průchodnosti, což je zásadní pro objev biomarkerů a kvantitativní modelování biologických sítí.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky je zhodnotit pokrytí proteomu a kvantitativní výkonnost platformy Evosep Eno v kombinaci s Orbitrap Astral Zoom Mass Spectrometer při vysokopropustných nDIA (narrow-window DIA) metodách. Studie mapuje optimalizaci parametrů nDIA pro standardní Evosep metody (30, 60, 100, 200, 300, 500 SPD) a hodnotí kompromis mezi hloubkou proteomu, kvantitativní přesností a cyklem měření.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Vzor: Thermo Scientific Pierce HeLa Digest/PRTC Standard, typicky 200 ng na injekci; u 500 SPD byly analyzovány i dávky 50 ng a série PRTC od 1–100 fmol.
• Příprava: rehydratace lyofilizovaného digestu, přidání PRTC, načtení na Evotip Pure podle doporučeného protokolu, udržení tipů vlhkých při 4 °C před měřením.
• Chromatografie: Evosep Eno se šesti standardními režimy (30–500 SPD) a odpovídajícími Performance columns (délky 4 cm pro 200–500 SPD, 8 cm pro 60–100 SPD, 15 cm pro 30 SPD). Teplota kolony 40 °C (Evosep Pod).
• Akvizice: nDIA režim s optimalizovanými izolacními šířkami (IW) a maximálními injekčními časy (IT) přizpůsobenými SPD; globální Orbitrap full scan resolution 240 000; Astral detektor pro DIA MS2.
• Analýza dat: Biognosys Spectronaut 19.7 (directDIA) pro hromadné zpracování; MacCoss Lab Skyline-Daily pro metriky PRTC a kvantitativní křivky.

Použitá instrumentace

• Evosep Eno (Evosep Biosystems)
• Evosep Performance columns a Evotip Pure
• Evosep Pod (kolonový ohřev/kompatibilita s EASY-Spray)
• Thermo Scientific Orbitrap Astral Zoom Mass Spectrometer
• Thermo Scientific EASY-Spray Ion Source
• Software: Spectronaut 19.7 (Biognosys), Skyline-Daily V25.1

Hlavní výsledky a diskuse

• Hloubka proteomu a propustnost: Při ultra‑vysokém 500 SPD bylo z pěti replik 200 ng HeLa identifikováno více než 6 800 proteinových skupin a ~74 000 modifikovaných peptidů při efektivním injekčním intervalu ~2,9 minuty. Při nejdelším 30 SPD režimu dosáhli autoři až 10 595 proteinových skupin a ~190 732 modifikovaných peptidů (5 replik, 200 ng).
• Optimalizace nDIA parametrů: Pro 500 SPD bylo nejlepší vyvážení mezi hloubkou a kvantitativní přesností dosaženo s izolacní šířkou 4 Th a maximálním Astral IT 3 ms (v experimentu uvedeno i 3–6 Th a 3–5 ms testované). Ten zajišťuje dostatečný počet datových bodů na peak (DPPP) a současně dovoluje dosáhnout cílového AGC i u slabších precursorů.
• Kvantitativní přesnost: Medián CV proteinových skupin na všech standardních metodách nepřesáhl 5,2 %; u peptidů medián CV nepřekročil 13 %. Specificky pro 500 SPD byly zaznamenány mediány CV 4,4 % (protein groups) a 9,6 % (modifikované peptidy) při 3 replikách.
• Chromatografická robustnost: Při 94 po sobě jdoucích bězích 500 SPD byla retenční časová variabilita PRTC peptidů velmi nízká (sd < 0,4 s). Medián FWHM píků byl ~1,2 s a počet MS2 datových bodů na peak cca 6, což indikuje stabilní a funkční spojení rychlé chromatografie a rychlé akvizice Astral detektoru.
• Sensitivita a linearita: PRTC standardy spikované v rozsahu 66,7 amol až 6,7 fmol na peptid vykazovaly v nDIA dobrou linearitu (R² > 0,98), dokazující citlivost a kvantitativní konzistenci i při ultra‑rychlých runech.
• Dynamický rozsah: Nezaznamenal se žádný pokles fidelity signálu pro vysoce abundatní proteiny napříč všemi průtoky; platforma zachovala dynamický rozsah při predikovatelné závislosti hloubky pokrytí na délce gradientu.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysokopropustné studie: Kombinace Evosep Eno a Orbitrap Astral Zoom je vhodná pro studie s tisíci vzorků, např. klinické kohorty nebo screeningové kampaně, kde je nezbytná rychlá, reprodukovatelná a kvantitativně spolehlivá analýza.
• Rychlá label‑free kvantifikace: nDIA s úzkými okny zvyšuje selektivitu a snižuje míru chimérických spekter, což zlepšuje identifikaci a kvantifikaci bez nutnosti značkování.
• Standardizace a přenositelnost: Předdefinované Evosep metody (30–500 SPD) poskytují stabilní gradienty a opakovatelné retenční časy, což zjednodušuje multi‑laboratorní nasazení a škálování projektů.
• Operationalní efektivita: Krátké run‑times a jednoduchá integrace se zdrojovými komponentami (EASY‑Spray, Evosep Pod, Evotip) minimalizují provozní režii na pracovišti s vysokým průtokem vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zvyšování propustnosti: Další optimalizace IW/IT schémat a zpracování dat (pokročilejší algoritmy pro de‑mixing a identifikaci) mohou posunout hranice kompromisu mezi hloubkou pokrytí a rychlostí.
• Automatizace a workflowy pro kliniku: Integrace s robotizovanou preparací a robustními QA/QC skripty by mohla platformu učinit standardem pro velké translační projekty a validace biomarkerů.
• Rozšířená aplikovatelnost nDIA: nDIA by mohla být více využívána pro studium PTM, cílené kvantifikace a multi‑omics integrace díky lepšímu oddělení precursorů při krátkých gradientech.
• Metodologické inovace: Kombinace vysokorychlostních detektorů s lepšími režimy řízení AGC a inteligentním výběrem oken by mohla dále zlepšit citlivost pro nízko abundantní analyty v ultra‑rychlých režimech.

Závěr

Platforma Evosep Eno v kombinaci s Orbitrap Astral Zoom Mass Spectrometer poskytuje robustní a vysoce propustné řešení pro kvantitativní proteomiku. Při optimalizovaném nDIA protokolu byla dosažena vysoká hloubka pokrytí proteomu i při extrémně krátkých bězích (500 SPD), přičemž byly zachovány nízké CV, stabilní chromatografie a dobrá linearita detekce. Tato kombinace je vhodná pro rozsáhlé proteomické studie vyžadující rychlost, reprodukovatelnost a kvantitativní přesnost.

Reference

1. The six standard methods: Built for standardization. Evosep ApS, dokument metodického charakteru popisující standardní Evosep Eno režimy (30–500 SPD).
2. Reproducible, inter-laboratory, scalable, and routine LC-MS-based proteomics with the Evosep Eno. Evosep ApS, multi‑lab study application note (AN‑043B) dokumentující opakovatelnost a škálovatelnost platformy.
3. Loading protocol for Evotip Pure. Evosep ApS, provozní protokol pro správné načítání vzorků na Evotip (PR‑001D).
4. Evosep Pod user manual. Evosep ApS, uživatelský manuál pro Evosep Pod (UM‑002C) popisující obsluhu kolnového ohřevu a integraci s EASY‑Spray.