Optimized DDA+ and HR-DIA workflows for standardized, reproducible, precise and robust label-free quantitation of proteomes

Význam tématu

Label-free kvantifikace proteomů je klíčová pro biologický výzkum i průmyslovou analytiku, protože umožňuje přesné měření proteinů bez nutnosti značení. Robustnost, reprodukovatelnost a vysoká výtěžnost dat jsou zásadní pro důvěryhodné srovnávání v rozsáhlých studiích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo navrhnout a optimalizovat kompletní end-to-end workflow pro label-free kvantifikaci, které kombinuje data-dependent DDA+ a high-resolution DIA (HR-DIA). Studie se zaměřila na dosažení standardizovaných, reprodukovatelných a přesných výsledků při vysoké průchodnosti vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

• Kapilárně-mikroprůtokový chromatografický systém UltiMate 3000 RSLCnano s EASY-Spray 150 µm C18 sloupcem
• Hybridní kvadrupol-Orbitrapový hmotnostní spektrometr Q Exactive HF-X
• Software pro analýzu dat: Thermo Scientific Proteome Discoverer 2.2 pro DDA+ a Spectronaut v10 pro HR-DIA
• DDA+ nastavení: MS1 skeny 120 000 rozlišení, MS2 HCD top 40, izolační okno 1,2 m/z, dynamická exkluze 20 s
• HR-DIA nastavení: MS1 120 000 rozlišení, 80x10 Da široká DIA okna, optimalizovaná pro rychlou koizolaci a fragmentaci

Hlavní výsledky a diskuse

• Test 1000 injekcí HeLa digesu ukázal stabilní kvantitativní výkon s RSD < 5 % a trvale vysokým proteomickým pokrytím
• DDA+ algoritmus dramaticky snížil chybějící hodnoty; 97 % peptidů bylo reproducibilně kvantifikováno oproti 50 % u tradičního DDA
• HR-DIA zajistila rozsáhlé identifikace a kvantifikace proteinů díky vysokému rozlišení MS1 (120 000) a optimalizovaným DIA oknům (30 000 rozlišení MS2, 80 oken po 10 m/z)
• Oba workflowy udržují citlivost i při vyšší robustnosti a průtokových rychlostech, čímž kombinují výhody nano-LC i kapilární LC

Přínosy a praktické využití metody

• Standardizované procedury umožňují porovnávání dat v rozsáhlých kohortách a dlouhodobé projekty
• Vysoká přesnost a nízká variabilita (< 20 % cv pro většinu proteinů) podporují studie drobných biologických změn
• Workflow lze snadno škálovat a adaptovat pro QA/QC, farmaceutický výzkum a průmyslovou analytiku

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace optimalizace DIA oken pomocí scouting metod pro maximální výtěžnost a spolehlivost kvantifikace
• Rozvoj library-free přístupů a integrace umělé inteligence pro analýzu HR-DIA dat
• Implementace v klinické proteomice a personalizované medicíně pro rozsáhlé kohortové studie

Závěr

Kombinace DDA+ a HR-DIA workflowů poskytuje robustní, precizní a reprodukovatelné label-free kvantifikace proteomů při vysoké propustnosti. Tyto přístupy překonávají omezení tradičních LFQ protokolů a otevírají cestu pro rozsáhlé, standardizované studie.

Reference

1. A. Gajadhar. Pushing the leading edge in protein quantitation: Integrated, precise, and reproducible proteomic workflows. Slide Presentation. PlanetOrbitrap.com
2. Top reasons to upgrade to a Q Exactive HF-X hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer. Technical Guide/Grant Application Resource. PlanetOrbitrap.com
3. X. Zhang, A. Gajadhar, X. Sun, M. Baynham. A highly sensitive and robust 150 µm column to enable high-throughput proteomics. Application Note 21744. PlanetOrbitrap.com