MRMS aXelerate for targeted metabolomics profiling of myxobacterial extracts

Význam tématu

Myxobakteriální sekundární metabolity představují zdroj biologicky aktivních látek s širokým potenciálem v oblasti farmacie, biotechnologií i ekologického výzkumu. Analýza těchto komplexních extraktů vyžaduje vysokou citlivost, rozlišení a propustnost, aby bylo možné rychle a spolehlivě odhalit známé i nové přírodní produkty.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie je představit workflow MRMS aXelerate využívající analýzu pomocí flow injection analýzy na magnetickém rezonančním hmotnostním spektrometru (FIA-MRMS) pro cílené zpracování myxobakteriálních extraktů v rámci netargetovaného metabolomického přístupu. Studie rovněž porovnává kultivační podmínky (tekutá kultura vs. agarové plató) a ukazuje, jak lze pomocí statistické analýzy PCA vyhodnotit variace v produkci sekundárních metabolitů.

Použitá metodika a instrumentace

Myxococcus xanthus DK1622 byl kultivován v biologických triplikátech v tekutém médiu i na agarových platéch. Buňky byly lyofilizovány a extrahovány metanolem; blank vzorky představovalo extrahované médium. Všechny extrakty byly před měřením ředěny 1:200 a měřeny ve dvojích technických replikátech.

Použitá instrumentace

• Bruker scimaX MRMS se zdrojem ESI v kladném režimu, detekce fází s vysokým rozlišením (650 000 @ m/z 400), magnetická smyčka, rozsah m/z 107–3000, akumulace iontů 20 ms, 28 skenů za 1,5 min.
• Bruker Elute UHPLC s rozhraním ESI pro referenční UHPLC-UHR-Q-TOF měření.
• Ultimate 3000 RSLC (Dionex) spojený s maXis 4G UHR-Q-TOF (Bruker Daltonics), kolona C18 (100×2,1 mm, 1,7 µm), gradient 5–95 % acetonitril/voda, runtime 21 min.
• Software MetaboScape 4.0 pro detekci, blank subtrakci, anotaci a PCA.

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow FIA-MRMS umožnil snížení doby analýzy z ~21 min (LC-MS) na pouhých 1,5 min, což významně zvyšuje propustnost screeningových studií. Díky ultra vysokému rozlišení (>400 000) a hmotnostní přesnosti pod 1 ppm se podařilo detekovat slabě exprimovaný Myxovirescin H, který standardním LC-MS zůstal skrytý. Komplexita spekter byla redukována z 4786 na 295 významných signálů po automatické subtrakci blanku a anotaci dle databází (MetaboBASE, LMSD, Myxobase). PCA jasně oddělila vzorky tekuté kultury, agarových plat a blanků a pomohla identifikovat podmínky optimální pro produkci jednotlivých metabolitů (Myxovirescin A, Myxalamid A, Cittilin A, DKxanthene-534).

Přínosy a praktické využití metody

Workflow MRMS aXelerate přináší:

• Vysokou citlivost a ultra vysoké rozlišení pro detekci nízkokoncentrovaných metabolitů.
• Výrazné zkrácení doby měření (1,5 min vs. 21 min) pro vysokopropustné screeningy.
• Automatizovanou redukci dat, blank subtrakci a rychlou anotaci s přednastavenými i vlastně vytvářenými knihovnami.
• Možnost statistické evaluace (PCA) pro porovnání kultivačních systémů a rychlé rozhodování o prioritách při sběru vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace pokročilých AI nástrojů pro anotaci neznámých signálů, rozšíření databází o nové mz směry a fragmentační vzorky, implementace online platformy pro real-time vizualizaci výsledků a automatické rozhodovací algoritmy pro volbu optimálních kultivačních podmínek a čištění extraktů.

Závěr

MRMS aXelerate představuje inovativní přístup k cílené netargetované metabolomice myxobakteriálních extraktů. Kombinace vysokého rozlišení, citlivosti a krátkých dob měření s robustními nástroji pro zpracování dat umožňuje efektivní identifikaci sekundárních metabolitů a podporuje výzkum nových přírodních látek.

Reference

1. Krug D., Müller R. Secondary metabolomics… Nat. Prod. Rep. 2014;31:768–783.
2. Hoffmann T. a kol. Correlating chemical diversity… Nat. Commun. 2018;9:803.
3. Barsch A. a kol. Challenges in Metabolomics… Bruker Application Note 2010.
4. Wenzel S.C., Müller R. Myxobacteria – microbial factories… Mol. Biosyst. 2009;5:567–574.
5. Hug J.J. a kol. Concepts and Methods to Access Novel Antibiotics… Antibiotics 2018;7:44.
6. Krug D. a kol. Analysis of secondary metabolites… Bruker Application Note 2007.
7. Fahy E. a kol. Update of the LIPID MAPS… J. Lipid Res. 2009;50 Suppl:S9–14.