Magnetic Resonance Mass Spectrometry (MRMS) discriminates yeast mutants through metabolomics

Význam tématu

Metabolomika poskytuje cenné poznatky o buněčných metabolických drahách a umožňuje rozlišit i fenotypicky identické, geneticky velmi podobné mikroorganismy. Methylglyoxal je cytotoxický vedlejší produkt glykolýzy, jehož detoxifikace je zásadní pro udržení buněčné homeostázy. Segmentace metabolických profilů na základě vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie s magnetickým rezonancí (MRMS) přináší dosud nevídanou schopnost odhalit jemné změny v metabolických drahách.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ověřit, zda metoda MRMS aXelerate® dokáže rozlišit jednotlivé mutanty kvasinek Saccharomyces cerevisiae s nerozlišitelným fenotypem, u nichž bylo vyřazeno jedno z genů odpovědných za metabolismus methylglyoxalu (GLO1, GLO2, GRE3). Autoři sledovali změny v koncentraci metabolitů, zejména glutathionu, a vyhodnotili diskriminační schopnost metody.

Použitá metodika a instrumentace

• Modelový organismus: Saccharomyces cerevisiae (BY4741, ΔGLO1, ΔGLO2, ΔGRE3)
• Příprava vzorku: kultivace v YPD médiu při 30 °C, extrakce metabolitů methanol/voda (1:1), přidání formiové kyseliny a interního standardu leucine-enkephalinu
• Analýza: direct infusion MRMS (solariX XR 7T, ESI+, až 1 000 000 rozlišení @ m/z 400), 100 skenů
• Softwarové zpracování dat: MetaboScape® 4.0 s algoritmem T-ReX® pro zarovnání a normalizaci signálů, identifikace pomocí SmartFormula (≤0,2 ppm) a databází YMDB a HMDB
• Statistické metody: PCA, hierarchické seskupování, PLS-DA s výpočtem VIP skóre

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda odhalila přes 21 000 unikátních signálů, z nichž bylo 624 přiřazeno přes HMDB a 3 943 potvrzeno molekulovou formulí. PCA a hierarchická analýza jasně rozdělily vzorky do dvou skupin: jednu tvořily buňky s neporušenou glyoxalázovou drahou (BY4741, ΔGRE3) a druhou mutanty ΔGLO1 a ΔGLO2. Glutathion se ukázal jako hlavní diskriminační biomarker (VIP nejvyšší hodnota), jehož koncentrace byla snížena zejména u ΔGLO2, což odpovídá nemožnosti regenerace redukované formy. Vysoké rozlišení MRMS navíc umožnilo identifikovat až dvanáct izotopologů glutathionu a přesně určovat jeho molekulovou formuli.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda umožňuje spolehlivě rozlišit geneticky téměř identické kmeny bez nutnosti sekvenování genomu či proteomické analýzy
• Poskytuje komplexní pohled na metabolické změny, což je klíčové pro biotypizaci mikroorganismů, QA/QC v potravinářství a biotechnologiích
• Vysoké rozlišení a přesnost MRMS zajišťují jednoznačnou identifikaci malých molekul a jejich izotopologů

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření MRMS ve vysokopropustných metabolomických platformách pro screening mikrobiálních kmenů a v environmentální analýze. Kombinace s chromatografickými technikami a pokročilou bioinformatikou může dále zvýšit separační schopnost a odhalit dosud nepoznané metabolity. Ve farmaceutickém a biotechnologickém průmyslu lze využít workflow aXelerate® pro validaci výrobních kmenů a sledování stresových odpovědí.

Závěr

Workflow MRMS aXelerate® pro untargeted metabolomiku prokázalo vysokou citlivost a selektivitu při rozlišení kvasinkových mutantů s rozdílnými enzymy glyoxalázové dráhy. Klíčovým ukazatelem byl glutathion, jehož distribuce umožnila jasné rozdělení vzorků. Výsledky potvrzují, že metabolomická biotypizace mikroorganismů může překonat tradiční molekulární metody a otevírá nové možnosti v analytické chemii.

Reference

• Gomes RA, Sousa Silva M, Vicente Miranda H, Ferreira AEN, Cordeiro CAA, Freire AP. Protein glycation in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Journal. 2005;272:4521–4531
• Kuepfer L, Sauer U, Blank LM. Metabolic functions of duplicate genes in Saccharomyces cerevisiae. Genome Research. 2005;15(10):1421–1430
• Ramirez-Gaona M, Marcu A, Pon A, Guo AC, Sajed T, Wishart DS. YMDB 2.0: a significantly expanded version of the yeast metabolome database. Nucleic Acids Research. 2017;45(D1):D440–D445
• Sousa Silva M, Gomes RA, Ferreira AE, Ponces Freire A, Cordeiro C. The glyoxalase pathway: the first hundred years... and beyond. Biochemical Journal. 2013;453(1):1–15
• Vander Jagt DL, Hunsaker LA. Methylglyoxal metabolism and diabetic complications: roles of aldose reductase, glyoxalase-I, betaine aldehyde dehydrogenase and 2-oxoaldehyde dehydrogenase. Chemical Biology Interactions. 2003;143–144:341–351
• Wagner A. Robustness against mutations in genetic networks of yeast. Nature Genetics. 2000;24(4):355–361
• Winzeler EA, et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 1999;285(5429):901–906
• Wishart DS, et al. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Research. 2007;35(Database issue):D521–D526