RNA Analysis for CRISPR by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection

Význam tématu

CRISPR/Cas9 je moderní nástroj pro editaci genů využívaný ve farmacii a biotechnologiích pro přesné zásahy do genomu. Kvalitní analýza sgRNA a Cas9 mRNA je klíčová pro ověření integrity a čistoty terapeutických RNA směsí, což ovlivňuje efektivitu genové terapie a spolehlivost preklinického výzkumu.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje kapilární elektroforézu s laserovou indukovanou fluorescencí (CE-LIF) pro simultánní analýzu single guide RNA (sgRNA) a Cas9 mRNA v jedné gelové matrici. Cílem je zjednodušit a urychlit rutinní testování RNA komponent CRISPR/Cas9 systému, snížit náklady a zvýšit efektivitu.

Použitá metodika a instrumentace

• Instrumentace: PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System se LIF detektorem (488 nm excitace, 520 nm emise).
• Gelová matrice: eCAP ssDNA 100-R kit (undiluted pro sgRNA a pd(A) 40–60, 2,8× na Cas9 mRNA).
• Sep. pufr: 7 M urea v Tris-Borate buffru se SYBR Green II.
• Parametry: sgRNA 30 kV/50 min, Cas9 mRNA 6 kV/75 min; teploty 20–30 °C podle analyzované RNA.
• Kalibrace: LIF Calibration Wizard s Performance Test Mix.

Hlavní výsledky a diskuse

• sgRNA (100 nt) detekována jako hlavní pik ~36 min, čistota 45,1 % (identifikovány n-1 nečistoty 16–35,8 min).
• pd(A) 40–60 Test Mix: detekováno 21 špiček (40–60 nt) a doplňující n-1 fragmenty, single-base rozlišení od 15 nt.
• Cas9 mRNA (~4,5 kb) hlavní pik ~66,7 min s čistotou 58,1 %, doprovázen degradovanými fragmenty 3 kb, 2,5 kb, 2 kb, 1,5 kb a dalšími menšími produkty (zvýšená základna).
• Opakovatelnost: %RSD migračního času <0,7 %, %RSD korigované plochy <2,8 % pro RNA markery 0,2–10 kb.

Přínosy a praktické využití metody

• Analýza obou RNA komponent (sgRNA, Cas9 mRNA) v jednom běhu a jedné matrici.
• Úspora času a spotřebního materiálu díky předpřipraveným gelům.
• Vysoké rozlišení nečistot, přesná kvantifikace a odhad velikosti degradovaných fragmentů.
• Robustní opakovatelnost vhodná pro rutinní QA/QC laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace a vysokopropustné formáty CE-LIF pro screening velkého počtu vzorků.
• Vývoj nových fluorescenčních barviv a gelových matric pro rozšíření rozsahu velikostí RNA.
• Integrace s online sekvenačními technologiemi pro detailní charakterizaci nečistot.
• Adaptace metody na další RNA terapie a modifikované RNA struktury.

Závěr

CE-LIF metoda s eCAP ssDNA 100-R kitem nabízí spolehlivou a efektivní cestu k simultánní analýze sgRNA a Cas9 mRNA. Metoda zjednodušuje workflow CRISPR aplikací, umožňuje přesné rozlišení degradovaných produktů a poskytuje vysokou reprodukovatelnost v laboratorních podmínkách.

Reference

• Three ways CRISPR will change the drug world. (2019) Optum Resources.
• Alt-R CRISPR-Cas9 sgRNAs. IDT product brochure CRS-10142-FL 07/19.
• Capillary electrophoresis of oligonucleotides. (2011) Integrated DNA Technologies.