From Narrow to Ultrawide Pores: Characterization of mAbs, AAVs, mRNA, and pDNA

Význam tématu

Analýza velikostní heterogenity biofarmaceutik (mAbs, AAV, mRNA, pDNA) je klíčová pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti léčiv. Agregáty a fragmenty ovlivňují stabilitu, imunitní odpověď a farmakologické vlastnosti produktů; současně se molekulární velikosti těchto modalit liší o několik řádů velikosti, což vyžaduje adaptabilní analytické přístupy. Size‑exclusion chromatography (SEC) s rozšířenou škálou pórů a sub‑3 µm částicemi umožňuje studium těchto různorodých konstrukcí v nativních podmínkách a podporuje vícečetné detekční techniky (UV, FLD, MALS, MS).

Cíle a přehled studie / článku

Text hodnotí celou řadu Agilent AdvanceBio SEC kolon (2.7 µm) s pórmi 130 Å až 1000 Å pro charakterizaci monoclonálních protilátek, adeno‑asociovaných virů (AAV), mRNA a plazmidové DNA (pDNA). Cílem bylo určit optimální pórovitost pro danou modalitu, demonstrovat možnosti separace monomerů, agregátů a fragmentů v jednom chromatografickém běhu nebo v sérii kolón, a ukázat praktické použití jednotného pufru pro různé analýzy.

Použitá metodika

• Rovinná SEC separace s mobilem: 50 mM fosfátový pufr + 400 mM NaCl, pH 7.2; průtok typicky 0.35 mL/min; teplota kolony 25 °C; doba běhu 24 min.
• Detekce: UV (260 nm pro nukleové kyseliny, 280 nm pro proteiny) a fluorescenční detekce (Ex 280 nm / Em 348 nm) pro zvýšenou citlivost zejména u AAV agregátů.
• Přístupy: použití jednotlivých kolón s různou pórovitostí (130, 300, 500, 1000 Å), sériové zapojení kolón (1000 Å + 300 Å) pro rozšířenou separační schopnost, a variace průtoku pro studium slalom/HDC efektů u velkých pDNA/mRNA.
• Příprava vzorků: tepelný stres mAb, restrikční linearizace pDNA, RNázové digesy mRNA, použití ssRNA žebříčku a směsí Cas9 mRNA + sgRNA pro posouzení rozlišení koformulovaných komponent.

Použitá instrumentace

• Pumpa: Agilent 1260 Infinity II Bio‑Inert Pump (G5654A)
• Autosampler: Agilent 1260 Infinity II Bio‑Inert Multisampler (G5668A)
• Kolonová komora: Agilent 1260 Infinity II Multicolumn Thermostat (G7116A)
• Detektor DAD: Agilent 1260 Infinity II Diode Array Detector (G7115A) s Bio‑Inert UV flow celou 13 µL, 10 mm
• Fluorescenční detektor: Agilent 1260 Infinity II FLD (G7121B) s 8 µL flow celou
• Software: Agilent OpenLab CDS (v. 2.7)
• Kolony: Agilent AdvanceBio SEC 2.7 µm v rozměrech 4.6×300 mm a 4.6×150 mm s pórami 130, 300, 500, 1000 Å

Hlavní výsledky a diskuse

• Volba pórovitosti je kritická: 300 Å je optimální pro separaci bílkovinných vzorků (mAb, BSA), zatímco větší modality (AAV, mRNA, velké pDNA) vyžadují 500–1000 Å, aby bylo možné rozlišit agregáty a nechtěné duplexní/neúplné formy.
• AAV: 500 Å kolona s FLD poskytuje citlivé zobrazení agregátů. Poměr A260/280 slouží k rozlišení naplněných a prázdných kapsid (přibližně 1.2 pro naplněné, ~0.7 pro empty).
• mRNA: 1000 Å kolona efektivně rozlišuje dsRNA nečistoty od hlavního mRNA peaku. Série 1000 Å + 300 Å výrazně zlepšuje rozlišení fragmentů po RNázové digesti a koformulací Cas9 mRNA + sgRNA, kde menší póry pomáhají izolovat kratší oligonukleotidy a poly(A) řetězce.
• pDNA: ultradelší molekuly (>100 nm) se obvykle vylučují z pórů; HDC / slalom chování a viskoelastické natažení při vyšších průtocích dominuje separaci. Lineární pDNA se při vyšších rychlostech více natahuje než superkoilho‑vá forma, což se projeví rozdílnou změnou retenčního objemu.
• mAb: 300 Å kolona umožňuje kvantifikovat HMW a LMW varianty (včetně 100 kDa mAb‑Fab a ~50 kDa Fab). Pro oddělení mAb‑Fab od monomeru může být vhodná i menší pórovitost/částice (1.9 µm, 200 Å).

Přínosy a praktické využití metody

• AdvanceBio SEC kolony nabízejí flexibilitu pro široké spektrum bioterapeutik, umožňují jednotný mobilní fázi pro různé analýzy a podporují kombinaci detekcí (UV/FLD/MALS/MS).
• Sériové kombinace pórů (1000 Å + 300 Å) představují praktické řešení pro analýzy, kde je potřeba současně rozlišit velmi velké molekuly a drobné fragmenty v jednom běhu.
• Metoda poskytuje nástroj pro rutinní QC i R&D: monitorování agregace AAV, dsRNA nečistot v mRNA produktech, topologické profiling pDNA a běžné mAb stability během stresových studií.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozvoj SEC materiálů se zaměřením na zvýšení mechanické stability a ještě širší spektrum pórů umožní robustnější analýzy LNPs a dalších nanodelivery systémů.
• Integrace SEC s MALS, MS a dalšími orthogonálními metodami poskytne kvantitativnější informace o molární hmotnosti, konformaci a identitě impurit.
• Vyšší průtoky a optimalizace slalom/HDC parametrů mohou zlepšit topologické profilování dlouhých pDNA a komplexních RNA formulací.
• Automatizace a validované workflow pro QC v GMP prostředí budou klíčové pro širší adopci SEC v gene‑therapy a mRNA výrobě.

Závěr

SEC s rozšířeným rozsahem pórů (130–1000 Å) a sub‑3 µm částicemi je univerzálním nástrojem pro charakterizaci široké škály bioterapeutik. Správná volba pórovitosti a případné sériové zapojení kolón umožňují robustní rozlišení monomerů, agregátů a fragmentů v jednom analytickém nastavení. Metoda je prakticky aplikovatelná jak v R&D, tak v QC a lze ji doplnit o citlivé detekční techniky pro zvýšení analytické hodnoty dat.

Reference

1. Wang D.; Stevens G.; Flotte T.R. Gene Therapy Then and Now: A Look Back at Changes in the Field Over the Past 25 Years. Mol. Ther. 2025, 5, 1889–1902.
2. D'Atri V.; Imiołek M.; Quinn C.; Finny A.; Lauber M.; Fekete S.; Guillarme D. Size Exclusion Chromatography of Biopharmaceutical Products: From Current Practices for Proteins to Emerging Trends for Viral Vectors, Nucleic Acids and Lipid Nanoparticles. J. Chromatogr. A. 2024, 1722, 464862.
3. Harris R.J.; Kabakoff B.; Macchi F.D.; Shen F.J.; Kwong M.; Andya J.D.; Shire S.J.; Bjork N.; Totpal K.; Chen A.B. Identification of Multiple Sources of Charge Heterogeneity in a Recombinant Antibody. J. Chromatogr. B. 2001, 752, 233–245.
4. Verscheure L.; Vanhoenacker G.; Schneider S.; Merchiers T.; Storms J.; Sandra P.; Lynen F.; Sandra K. 3D-LC-MS with 2D Multimethod Option for Fully Automated Assessment of Multiple Attributes of Monoclonal Antibodies Directly from Cell Culture Supernatants. Anal. Chem. 2022, 17, 6502–6511.
5. De Vos J.; Vanluchene H.; Sandra P.; Sandra K.; Blackwell A.; Rachamim A. Determining AAV Critical Quality Attributes with Size Exclusion Chromatography and Multiple Detectors. Agilent Technologies application note, publication number 5994-8897EN, 2025.
6. Malburet C.; Leclercq L.; Cotte J.F.; Thiebaud J.; Bazin E.; Garinot M.; Cottet H. Taylor Dispersion Analysis to Support Lipid-Nanoparticle Formulations for mRNA Vaccines. Gene. Ther. 2023, 5, 421–428.
7. De Vos J.; Morreel K.; Alvarez P.; Vanluchene H.; Vankeirsbilck R.; Sandra P.; Sandra K. Evaluation of Size‑Exclusion Chromatography, Multi‑Angle Light Scattering Detection and Mass Photometry for the Characterization of mRNA. J. Chromatogr. A. 2024, 1719, 464756.
8. Gritti F. Ultra‑High Pressure Slalom Chromatography: Application to the Characterization of Large DNA and RNA Samples Relevant in Cell and Gene Therapy. J. Chromatogr. A. 2024, 1738, 465487.