CRISPR Single Guide RNA Characterization by IP- RP-LC-MS with a Premier Oligonucleotide BEH 300 Å C18 Column

Význam tématu

CRISPR/Cas systémy se staly klíčovým nástrojem v genomickém inženýrství díky vysoké přesnosti editace a možnosti cílené úpravy DNA. Kvalita a účinnost této technologie závisí na přesném složení a integritě jednovláknové vodicí RNA (sgRNA), která řídí lokalizaci a aktivitu endonukleázy Cas9. Pokročilé analytické metody dokáží ověřit identitu, čistotu i modifikace sgRNA, což je zásadní pro minimalizaci nežádoucích off-target efektů v biomedicínských a biotechnologických aplikacích.

Cíle a přehled studie

Cílem tohoto Application Note bylo ukázat robustní workflow pro charakterizaci syntetické sgRNA metodou iontově-párové reverzní fáze LC spojené s hmotnostní spektrometrií (IP-RP-LC-MS). Studie se zaměřila na dvě úrovně analýzy: intactní hmotnostní stanovení celého sgRNA a detailní oligo-mapování po enzymatické digesti RNázou T1. Klíčovým prvkem je použití kolony ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 300 Å pro spolehlivé rozlišení intactního i štěpeného RNA materiálu.

Použitá metodika a instrumentace

IP-RP-LC-MS intactní sgRNA:

• LC systém ACQUITY UPLC I-Class FTN s UV detektorem (260/280 nm)
• Kolona Premier Oligonucleotide BEH C18, 300 Å, 1.7 μm, 2.1×100 mm, 70 °C
• Mobilní fáze A: 0.1 % DIPEA/1 % HFIP ve vodě; B: 0.0375 % DIPEA/0.075 % HFIP v 65:35 acetonitril/voda
• Detektor ACQUITY RDa v negativním módu, full scan 400–5000 m/z

Oligo-mapování po RNáze T1:

• Denaturace RNA v 8 M ureu, digest RNázou T1 (37 °C, 30 min)
• ACQUITY UPLC Premier BSM systém s detekcí UV (260 nm)
• Kolona Premier Oligonucleotide BEH C18, 300 Å, 1.7 μm, 2.1×150 mm, 70 °C
• Vion QTof MS systém v negativním módu, mass range 50–4000 m/z, inteligentní sběr dat

Informatika:

• In silico digestovní kalkulátor (mRNA Cleaver)
• Softwarové moduly waters_connect, UNIFI, CONFIRM Sequence, Intact Mass

Hlavní výsledky a diskuse

Intactní analýza umožnila rozlišení hlavního špičkového pásu sgRNA od případných short-failure sekvencí a aduktů. Deconvolucí bylo dosaženo experimentální hmotnosti 32 242 Da, což odpovídá očekávaným 32 240 Da. Oligo-mapování RNázou T1 vedlo k identifikaci 15 teoretických fragmentů RNA s >98 % pokrytím sekvence i modifikací. Chromatografické rozlišení diastereomerů fosforotioátově modifikovaných koncových oligonukleotidů prokázalo schopnost metody detekovat i neúplnou thiolaci konců sgRNA.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní kontrola integrity a čistoty syntetické sgRNA
• Přímé stanovení intactní hmotnosti a podrobná sekvenační data bez cDNA redakce
• Rychlé a spolehlivé oligo-mapování bez nutnosti dodatečného čištění vzorku
• Detekce a kvantifikace modifikací (2’-O-methyl, fosforotioát)

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda může být rozšířena o další enzymové digestní přístupy pro zajištění 100 % pokrytí sekvence. Kombinace s iontovou mobilitou či vyšším rozlišením MS přinese lepší separaci diastereomerů i komplexnější analýzu mRNA vakcín a terapeutických oligonukleotidů. Integrace s bioinformatickými nástroji a strojovým učením zvýší automatizaci vyhodnocení dat a podporu regulovaných postupů QA/QC.

Závěr

IP-RP-LC-MS s kolonu ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 představuje univerzální platformu pro integrovanou analýzu intactních a štěpených sgRNA. Ukázali jsme, že lze rychle ověřit molekulární hmotnost, sekvenci, modifikace i čistotu vodicí RNA používané v CRISPR/Cas9 aplikacích, což zajišťuje vysokou kvalitu genomových editačních reagentů.

Reference

• Barrangou R. a kol., CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 2007; 315(5819):1709–12.
• Deltcheva E. a kol., CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 2011; 471(7340):602–7.
• Jinek M. a kol., A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 2012; 337(6096):816–21.
• Shao M., Xu T.R., Chen C.S., The Big Bang of Genome editing technology: development and application of the CRISPR/Cas9 system in disease animal models. Dongwuxue Yanjiu 2016; 37(4):191–204.
• Mohr S.E. a kol., CRISPR guide RNA design for research applications. Febs j 2016; 283(17):3232–8.
• Pennisi E., The CRISPR craze. Science 2013; 341(6148):833–6.
• Charpentier E., Elsholz A., Marchfelder A., CRISPR-Cas: more than ten years and still full of mysteries. RNA Biology 2019; 16(4):377–379.
• Gaye M.M. a kol., Synthetic mRNA Oligo-Mapping Using Ion-Pairing Liquid Chromatography and Mass Spectrometry. Waters Appl. Note 720007669, 2022.
• Asmamaw M., Zawdie B., Mechanism and Applications of CRISPR/Cas-9-Mediated Genome Editing. Biologics 2021; 15:353–361.