Multiclass veterinary drug screening and quantitation by high-resolution mass spectrometry (HRMS) using the Orbitrap Exploris 120 mass spectrometer

Význam tématu

Analýza reziduí veterinárních léčiv v potravinářských živočišných produktech je klíčová pro ochranu veřejného zdraví a dodržování regulačních limitů. Metody založené na LC-HRMS umožňují rychlé a spolehlivé vícenásobné screeningy různorodých chemických tříd sloučenin v komplexním vzorku, jako je hovězí svalovina, a současně nabízí dostatečnou citlivost pro splnění požadavků AOAC SMPR.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout a ověřit vysoce rozlišovací HRMS metodu pro screening a kvantifikaci 109 veterinárních léčiv v hovězí svalovině podle požadavků AOAC SMPR 2018.010. Studie zahrnovala porovnání různých způsobů čištění extraktů, optimalizaci režimů akvizice dat (DIA a DDA) a ověření výkonu metody pomocí POD experimentu a certifikovaného referenčního materiálu BOTS-1.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Vanquish Flex (Thermo Fisher Scientific)
• Kolona Accucore VDX 100×2,1 mm, 2,6 µm
• Orbitrap Exploris 120 HRMS (Thermo Fisher Scientific)
• Softwarové prostředí TraceFinder pro zpracování dat a knihovna mzVault/mzCloud pro potvrzování fragmentů

Použitá metodika

Vzorky hovězí svaloviny byly homogenizovány a extrahovány modifikovaným protokolem QuEChERS (acetonitril, pufr amonný oxalát/EDTA, sulfid sodný). Pročištění extraktu bylo prováděno buď dispersní SPE (CEC18), nebo SPE kolonkou HyperSep Retain-PEP. Vyhodnoceno bylo také zamražení extraktu na -20 °C (bez dostatečné reproducibility). Separace probíhala gradientem vody a směsi metanol–acetonitril s přídavkem formiátu kyseliny. Akvizice MS v pozitivním i negativním módu byla realizována datově nezávisle (DIA, 4 nebo optimalizovaný počet izolací) a datově závisle (DDA s inclusion listem).

Hlavní výsledky a diskuse

• Pročištění pomocí CEC18 dSPE a samostatné SPE přineslo nejlepší vymýtitelnost a stabilitu metodiky. Zamrazení extraktu nepřineslo opakovatelné výsledky a bylo z metodiky vyřazeno.
• Mini-POD experiment (10 replik při ½ MRL, 10 replik při 1× MRL) prokázal POD ≥ 0,8 pro drtivou většinu analyzovaných sloučenin a spolehlivou detekci i potvrzování pomocí fragmentů (mass accuracy < 5 ppm, S/N ≥ 3).
• Optimalizace DIA s 17 okny izolace zvýšila selektivitu pro nízkokoncentrované analyty (např. monensin při 1 ng/g byl potvrzen s POD = 1,0).
• Kvantifikace v CRM BOTS-1 (3 biologické repliky) vykázala hodnoty v souladu s certifikovanými údaji (odchylka < 15 %).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rutinní vícenásobné screenování a kvantifikaci širokého spektra veterinárních léčiv ve složitých živočišných matricích. Díky vysoké rozlišovací schopnosti Orbitrapu Exploris 120 lze zajistit splnění globálních MRL a současně zkrátit čas a počet separačních běhů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu analyzovaných léčiv a metabolitů včetně nových farmakologických tříd
• Automatizace přípravy vzorků a čištění extraktů ve vysokopropustném režimu
• Využití pokročilých algoritmů pro inteligentní výběr oken izolace v DIA
• Integrace s databázemi a cloudovými službami pro rychlejší potvrzování a validaci výsledků

Závěr

Orbitrap Exploris 120 HRMS ve spojení s modifikovaným QuEChERS protokolem a CEC18 dSPE poskytuje spolehlivou a citlivou metodu pro screening i kvantifikaci více než 100 veterinárních léčiv v hovězí svalovině. Metoda splňuje požadavky AOAC SMPR a nabízí robustní platformu pro rutinní analytiku a kontrolu kvality potravin.

Reference

1. European Commission Decision 2002/657/EC implementing Directive 96/23/EC concerning method performance and result interpretation.
2. Electronic Code of Federal Regulations Title 21, Subchapter E – Animal Drugs, Feeds, and Related Products.
3. AOAC SMPR 2018.010 Multi-Class Veterinary Drug Residue Method Performance Requirements.
4. Guidance Document SANTE/12682/2019 on probability of detection (POD) statistical model.