Automated MHC-Associated Peptide Enrichment for Immunopeptidomics Analysis Using Agilent AssayMAP Bravo Large Capacity Cartridges

Význam tématu

Imunopeptidomika se zaměřuje na analýzu peptidů navázaných na molekuly MHC-I, které hrají klíčovou roli v rozpoznávání infikovaných či nádorových buněk cytotoxickými T-lymfocyty. Precizní identifikace těchto peptidů je nezbytná pro vývoj vakcín, imunoterapií a zkoumání mechanismů imunitní odpovědi.

Cíle a přehled studie / článku

Studie popisuje plně automatizovanou metodu obohacení MHC-I asociovaných peptidů s využitím platformy Agilent AssayMAP Bravo a velkokapacitních (25 µL) PAW cartridgí. Cílem bylo dosáhnout vysoké reprodukovatelnosti, citlivosti a škálovatelnosti obohacení pro následnou nano-ULC/MS analýzu.

Použitá metodika a instrumentace

• Automatický liquid handler Agilent AssayMAP Bravo s cartridgemi 25 µL PAW (protein A) a 5 µL C18
• Imobilizace anti-MHC-I protilátky (w6/32) na protein A pomocí dimethyl pimelimidate (DMP) a crosslinkingu
• Imunoadsorpce MHC-I komplexů z GRANTA-519 buněčného lysátu (3 mg na cartridge)
• Eluce MHC-I komplexů v 1 % octové kyselině a kombinace eluátů
• Desalting a čištění peptidů na C18 cartridgích (30 % ACN/0,1 % TFA)
• Nano-LC separace na Agilent 1290 Infinity II UHPLC s Nanodapterem, kolonou C18 75 µm × 25 cm při 60 °C, gradient 90 minut
• MS/MS detekce na Agilent 6550 iFunnel Q-TOF v datově závislém akvizičním režimu (DDA, top 20 precursorů)
• Bioinformatická analýza v Byos workflow (Byonic pro identifikaci, Byologic pro kvantifikaci)

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizovaný protokol vedl k identifikaci 2 284–2 426 jedinečných MHC-I peptidů v jednotlivých vzorcích se CV < 3 %. Celkem bylo zjištěno 3 604 unikátních peptidů, z toho 1 351 v trojím překryvu. Distribuce délek ukázala, že 94 % peptidů má délku 8–11 aminokyselin (75 % 9-mery), což odpovídá literatuře. Logo analýza nonamerů odhalila preferenci L a V na pozicích 2 a C-terminu.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká reprodukovatelnost a citlivost obohacení MHC-I peptidů
• Minimalizovaná ruční manipulace a riziko variability
• Možnost paralelního zpracování více vzorků a snadné škálování
• Kompatibilita s konvenčními i nanoflow LC/MS systémy

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na analýzu MHC-II peptidomů a multiplexní detekci
• Integrace s automatizovaným workflow pro klinické vzorky a biomarkerový screening
• Optimalizace crosslinkingu a cartridge pro zvýšení výtěžnosti a životnosti
• Využití umělé inteligence pro rychlejší a přesnější bioinformatickou analýzu

Závěr

Popisovaný automatizovaný přístup s použitím AssayMAP Bravo, PAW a C18 cartridgí poskytuje stabilní, reprodukovatelnou a citlivou metodu pro izolaci a analýzu MHC-I peptidomů. Výsledky potvrzují robustnost postupu a jeho vhodnost pro rozšířenou aplikaci v imunoterapeutickém výzkumu.

Reference

• Hunt DF et al. Characterization of Peptides Bound to the Class I MHC Molecule HLA-A2.1 by Mass Spectrometry. Science. 1992;255(5049):1261–1263.
• Purcell AW, Ramarathinam SH, Ternette N. Mass Spectrometry-Based Identification of MHC-Bound Peptides for Immunopeptidomics. Nat Protoc. 2019;14(6):1687–1707.
• Caron E et al. Analysis of Major Histocompatibility Complex (MHC) Immunopeptidomes Using Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics. 2015;14(12):3105–3117.
• Wu S, Wu LF. Human Breast Cancer Cell Line Phosphoproteome Revealed by an Automated and Highly Selective Enrichment Workflow. Agilent Technologies Application Note 5994-0315EN;2018.