Automation of Sample Preparation for Accurate and Scalable Quantification and Characterization of Biotherapeutic Proteins Using the Agilent AssayMAP Bravo Platform

Význam tématu

Rychlá a spolehlivá příprava vzorků bílkovin je klíčová pro vývoj biotherapeutik. Automatizace eliminuje manuální chyby, zkracuje čas laborantů a umožňuje paralelní zpracování desítek až stovek vzorků s vysokou reprodukovatelností.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat výkonnost platformy Agilent AssayMAP Bravo při automatizovaném čištění, štěpení a přípravě peptidů z monoklonálních protilátek (mAb) pro LC/MS analýzu. Studie hodnotila kvantitativní obnovu protilátek, reprodukovatelnost, dosažitelné sekvenční pokrytí a minimální objemy eluátů.

Použitá metodika a instrumentace

Automatizovaný pracovní postup sestával ze tří navazujících aplikací:

• Affinity Purification: čištění protilátek na kartridžích PA-W (protein A) a PG-W (protein G)
• In-Solution Digestion: paralelní štěpení trypsinem, chymotrypsinem a Glu-C
• Peptide Cleanup: koncentrace a čištění peptidů na C18 reversed-phase kartridžích

Použitá instrumentace

• Agilent AssayMAP Bravo s 96kanálovou stříkačkou
• PA-W a PG-W kartridže pro afinitní purifikaci
• C18 reversed-phase kartridže (5190-6532)
• Agilent 1260 Bio-Inert LC system s Poroshell 300SB-C18 kolonkou
• Agilent 1290 Infinity LC system a 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS s Dual Jet Stream ESI

Hlavní výsledky a diskuse

• Lineární obnova protilátek v rozmezí 1–100 µg při >90 % se standardní odchylkou <5 %.
• Minimální objem eluátu pod 10 µL při použití 5 % kyseliny octové, bez ztráty výtěžku.
• Reprodukovatelnost na úrovni CV <10 % napříč celou 96jádrovou deskou pro mAb kvantifikaci.
• Sekvenční pokrytí mAb dosáhlo 99 % (heavy chain) a 100 % (light chain) kombinací tří proteáz vs. maximálně 79 % při použití trypsinu samostatně.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný postup výrazně zvyšuje kapacitu laboratoře pro QC/QC analýzu biotherapeutik. Platforma minimalizuje čas náročné pipetáže, zajišťuje vysokou konzistenci dat a podporuje rychlé rozhodování ve vývojových fázích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj by mohl zahrnovat integraci s online LC/MS, rozšíření podpory dalších enzymů a adaptaci na analýzu posttranslačních modifikací. Vznikají také pokusy o plně integrované platformy s bioinformatikou pro okamžitou interpretaci výsledků.

Závěr

Agilent AssayMAP Bravo nabízí modulární a výkonnou platformu pro automatizovanou přípravu vzorků biotherapeutických protilátek. Kombinace afinity, štěpení a čištění na jednom zařízení vede k vysoké reprodukovatelnosti, vynikajícímu sekvenčnímu pokrytí a úsporám času.

Reference

• Russell JD et al. Automation for LC/MS Sample Preparation: High Throughput In-Solution Digestion and Peptide Cleanup Enabled by the Agilent AssayMAP Bravo Platform. Agilent Technologies Application Note 5991-2957EN, 2013.