Quantitative Analysis and Determination of Molecular Weight of siRNA Type Oligonucleotides by LCMS™-8060

Význam tématu

Oligonukleotidové léky typu siRNA představují perspektivní přístup v cílené genetické terapii. Pro jejich charakterizaci a kontrolu kvality je nezbytné přesné stanovení koncentrace a molekulové hmotnosti. Kombinace kapalinové chromatografie s triple kvadrupólovou hmotnostní spektrometrií (LC–QqQ MS) nabízí vysokou citlivost a široký dynamický rozsah, důležitý pro farmakokinetické studie i vývoj nových léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ukázat praktické využití LCMS-8060 ve selected ion monitoringu (SIM) pro kvantitativní analýzu a určení přesné molekulové hmotnosti dvojřetězcových siRNA oligonukleotidů AS-Oligo a SS-Oligo. Studie srovnala citlivost SIM s metodou multiple reaction monitoring (MRM).

Použitá metodika a instrumentace

Analýzu prováděla Shimadzu Nexera UHPLC se C18 kolonkou (100 × 2,1 mm, 1,7 μm) při 75 °C. Mobilní fáze A: 200 mM HFIP/7,5 mM TEA ve vodě, B: methanol; gradient 4 %→20 % B v 8 min, průtok 0,2 mL/min, objem injekce 10 μL.

Hmotnostní spektrometr LCMS-8060 s ESI v negativním režimu, Q3 scan m/z 500–1800, SIM pro m/z 1659,9 (AS) a 1666,0 (SS). Dekonvoluční analýzu prováděl software LabSolutions™.

Hlavní výsledky a diskuse

• SIM chromatogram ukázal eluci AS-Oligo v 6,88 min a SS-Oligo v 6,94 min (R = 0,3).
• Lineární kalibrace v rozsahu 1 fmol–10 000 fmol (R2 ≥ 0,995). LOD 1 fmol, LOQ 5 fmol (odpovídá ~3 ng/mL při 10 μL injekci).
• MRM nedosáhlo citlivosti SIM pro nízké koncentrace, LOQ nebyl detekován pod 50 fmol.
• Hmotnostní spektra obsahovala ionty se stopou 4–9 nábojů, pro dekonvoluci byly vybrány nejintenzivnější 8+ a 9+ ionty.
• Dekonvoluce poskytla molekulové hmotnosti 6 645,6 Da (AS) a 6 667,1 Da s chybou 0,4 Da resp. 1,9 Da.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost kvantifikace siRNA v širokém rozsahu.
• Rychlé stanovení přesné molekulové hmotnosti s odchylkou jen pár Da.
• Možnost sledovat biologickou dostupnost a stabilitu siRNA v biologických vzorcích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Multiplexní analýza různých oligonukleotidových léčiv jediným měřením.
• Integrace s vysoce výkonnými separacemi pro snížení rušivých matricových efektů.
• Automatizovaná dekonvoluce a interpretace spekter s využitím pokročilého softwaru.

Závěr

Studie potvrdila, že LC–QqQ MS ve SIM režimu je vhodným nástrojem pro kvantitativní analýzu siRNA oligonukleotidů s vynikající citlivostí a linearitou. Navíc umožňuje přesné určení molekulové hmotnosti pomocí dekonvoluce, což podporuje další využití této platformy při vývoji a kontrole kvality nukleotidových léčiv.

Reference

Seznam literatury nebyl v původním textu uveden.