Analysis of Intact Monoclonal Antibodies Using an M3 MicroLC with the TripleTOF® 6600

Význam tématu

Monoklonální protilátky se staly jedním z nejrychleji se rozvíjejících segmentů biotechnologického i farmaceutického průmyslu. Detailní charakterizace jejich primární struktury, heterogenity a posttranslačních modifikací je nezbytná pro vývoj nových léčiv, zajištění stability produktu a splnění požadavků regulačních norem. LC-MS analýza intaktních mAb nabízí komplexní přístup, ale tradiční metody náročné na vzorek a off-line desalting omezují citlivost a produktivitu.

Cíle a přehled studie

• Zhodnotit přesnost a citlivost mikroflow LC-MS metody se strategií on-column desaltingu pro kvantitativní a kvalitativní analýzu intaktních monoklonálních protilátek (mAb).
• Porovnat on-column desalting s klasickým off-line (na membráně) desaltingem z hlediska ztrát vzorku a limity detekce.
• Prokázat schopnost metody pokrýt široký lineární dynamický rozsah (0,1–100 ng) a analyzovat glykoformy a další PTM při nízkých nanogramových koncentracích.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: tři různé IgG1 (Waters Intact mAb Standard, trastuzumab, adalimumab) připravené sérií ředění v koncentracích 0,02–200 µg/ml, následný on-column desalting.
• MikroLC: SCIEX M3 MicroLC s kolonkou Waters ACQUITY UPLC M-Class Protein BEH C4 (300 Å, 1.7 µm, 300 µm × 50 mm), průtok 15 µl/min, celkový gradient 10 minut (3 min desalting při 20 % B, 7 min lineární gradient do 80 % B a návrat) při 60 °C.
• MS detekce: TripleTOF 6600 s DuoSpray zdrojem (25 µm I.D. elektroda), pozitivní mód, rozsah 1000–5000 m/z, IonSpray 5500 V (ISVF 0 V během desaltingu), teplota 300 °C, CM 25, GS1/GS2 35, DP 240, CE 25, akumulace 1 s.
• Software: BioPharmaView™ pro dekonvoluci a PTM analýzu; MultiQuant™ pro kvantifikaci a kalibraci (1/x vážení); PeakView® pro kontrolu reprodukovatelnosti.

Hlavní výsledky a diskuse

• Reprodukovatelnost: velmi nízké rozptyly retenčního času (STDEV 0,01 min) i intenzity píků napříč 3–4 replikami.
• Dynamický rozsah: lineární kvantifikace intaktních mAb v rozsahu 0,1–100 ng na kolonce (3 řády), u standardu až 50–1000 ng.
• Citlivost: detekce a charakterizace glykoform a PTM (pyroGlu, G0F, G1F, G2F atd.) při dávkách až 2,5 ng.
• On-column desalting vs off-line: výrazně nižší ztráty vzorku a vyšší intenzita signálu oproti membránovému desaltingu.
• Průchodnost: až ~140 vzorků za den díky krátkým přípravám a 10minutovým běhům.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimalizace přípravných kroků a rizika ztráty vzorku díky on-column desaltingu.
• Snížení spotřeby výchozího materiálu, enzymů i rozpouštědel.
• Robustní kvantifikace a kvalitativní profilování mAb v rámci vývoje bioterapeutik i QA/QC laboratoří.
• Vhodné pro rychlou validaci a stabilitní studie při kontrole kvality produktů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace glykopeptidové a MS/MS MRM analýzy pro hlubší charakterizaci PTM a glykoform.
• Další rozšíření dynamického rozsahu pomocí pokročilých regresních modelů.
• Automatizace on-line desaltingu a zkrácení doby přípravy pro klinické aplikace.
• Uplatnění pro další třídy bioterapeutik, včetně konjugovaných protilátek (ADC) a vakcín.
• Využití umělé inteligence a strojového učení pro zpracování velkých sad dat a predikci variability mAb.

Závěr

Popisovaný workflow využívající SCIEX M3 MicroLC na kolonce BEH C4 v kombinaci s TripleTOF 6600 a on-column desaltingem poskytuje robustní a vysoce citlivou platformu pro komplexní kvantitativní i kvalitativní analýzu intaktních monoklonálních protilátek. Výrazné zkrácení přípravných postupů, vysoká reprodukovatelnost a široký dynamický rozsah činí metodu ideální pro vývoj bioterapeutik, stabilitní studie i rutinní QA/QC kontrolu.

Reference

• Johansen E, Shin B-H, Hunter C. Simultaneous Quantitative and Qualitative Analysis of Proteolytic Digests of Therapeutic Monoclonal Antibodies Using a TripleTOF System. SCIEX Technical Note, Document No. 7460213-01.
• Johansen E, Albanese J, Hunter C. Analysis of Intact and Reduced Therapeutic Monoclonal Antibodies using the TripleTOF 5600 System. SCIEX Technical Note, Document No. 4220211-01.
• Wagner HM. Linear Programming Techniques for Regression Analysis. American Statistical Association Journal, 1959, s. 207–212.
• Albanese J, Hunter CL, Meitei NS. Profiling the Distribution of N-Glycosylation in Therapeutic Antibodies using the QTRAP 6500 System. SCIEX Technical Note, Document No. RUO-MKT-02-2590-A.