Preparation Scale-Up Of Complex Biological Samples For Deep N-Glycomic Analysis By CE-LIF and CESI-MS

Význam tématu

Analýza N-vázaných oligosacharidů je klíčová pro pochopení funkce a stability glykoproteinů v biomedicíně a biotechnologiích. Detailní glykomické profilování odhaluje modifikace ovlivňující biologickou aktivitu a kvalitu bioprocesních vzorků. Efektivní a škálovatelná příprava vzorku je zásadní pro dosažení vysoké citlivosti a rozsahu analýzy metodami CE-LIF a CESI-MS.

Cíle a přehled studie

Studie představuje inovativní workflow přípravy komplexních biologických vzorků pro hlubokou N-glykomickou analýzu. Cílem bylo vyvinout protokol umožňující zpracování až miligramových množství bílkovin bez srážení, snížení rušivého vlivu volných cukrů a zvýšení výtěžnosti značení oligosacharidů pro CE-LIF a CESI-MS.

Použitá metodika

Workflow zahrnuje následující kroky:

• Imobilizace glykoproteinů na aminosilikonových magnetických kuličkách ve fosfátovém pufru
• Denaturace pomocí lineárního teplotního gradientu (30 až 80 stupňů C) s glycerolovým doplňkem
• PNGase F enzymatická deglykosylace na kuličkách
• Evaporativní APTS značení reduktivní aminací při kontrolované teplotě
• Čištění a eluce magnetickým separátorem s acetonitrilem a vodou
• Analytická separace a detekce glykanů metodami CE-LIF a CESI-MS

Použitá instrumentace

• PA800 Plus Pharmaceutical Analysis System (CE-LIF s excitací 488 nm a detekcí 520 nm)
• CESI 8000 Plus High-Performance Separation - ESI Module s kapilárním cartridgem (91 cm, 30 um ID)
• QTRAP 6500+ LC-MS/MS System v negativním ionizačním režimu
• PCR přístroj PTC-100 Marshall Scientific pro řízený teplotní gradient
• Software 32 Karat 10.1 a PeakView 2.2

Hlavní výsledky a diskuse

Teplotní gradientní denaturace zabránila precipitaci vzorku při zpracování až 1,5 mg proteinu v objemu 50 μl. Odstranění volných cukrů zvýšilo efektivitu PNGase F digesce. Vysoká výtěžnost APTS značení a reprodukovatelnost protokolu byly potvrzeny RSD do 9,6 %. Pomocí CE-LIF a CESI-MS bylo detekováno a identifikováno 28 unikátních N-glykanů z lidského séra.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí robustní a citlivou analýzu glykoproteinové glykomy v komplexních vzorcích. Umožňuje kontrolu kvality bioprocesních vzorků, výzkum biomarkerů a optimalizaci biotechnologických výrob. Škálovatelnost a minimální ztráty analytů podporují vysokou přesnost glykomických profilů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s automatizovanými a robotizovanými laboratorními systémy
• Rozšíření multiplexního značení a kombinace s dalšími MS technikami
• Využití strojového učení pro interpretaci glykomických dat
• Adaptace workflow na jiné posttranslační modifikace a komplexní biomolekuly

Závěr

Předložený protokol pro scale-up přípravy vzorku umožnil bezproblémové hluboké N-glykomické mapování komplexních biologických vzorků. Kombinace magnetického zachytu, teplotního gradientu denaturace a evaporativního značení vedla k vysoké citlivosti a reprodukovatelnosti analýzy CE-LIF a CESI-MS.

Reference

• Anderson NL Anderson NG The human plasma proteome history character and diagnostic prospects Mol Cell Proteomics 2002 1(11) 845-67
• Varki A et al Essentials of Glycobiology 2nd ed 2009 Plainview NY Cold Spring Harbor Laboratory Press
• Reider B Szigeti M Guttman A Evaporative fluorophore labeling of carbohydrates via reductive amination Talanta 2018 185 365-9
• Szigeti M Guttman A Sample preparation scale-up for deep N-glycomic analysis of human serum by capillary electrophoresis and CE-ESI-MS Mol Cell Proteomics 2019 18(12) 2524-31
• Harvey DJ et al Symbol nomenclature for representing glycan structures Extension to cover different carbohydrate types Proteomics 2011 11(22) 4291-5